对大部分临床专业的申请人来说，国自然中最难的地方是
分子机制
，原因多样：
比如大家对分子机制的认识不同，即使是评审专家也没有固定统一的看法，更重要的是在不同的方向代码下，对细胞分子机制的深度要求也不同
，下面我们就这个问题展开说一下。
总的来说，机制的深度可以分为
6
层（个人观点），但并不代表所有代码下的研究都需要做完。
细胞与分子机制的起点是表型和通路指标的检测，所以指标检测是必做部分。比如
前期预实验中发现
A
基因促进了细胞线粒体自噬
，除了通过电镜、显微镜等形态确定外，还需要检测细胞自噬以及线粒体自噬关键的指标，比如
LC3-II/LC3-I
比值、
p62
、
ATGs
等，但需要注意的是：
由于细胞自噬的方式很多，因此不仅要检测上述自噬指标，还需要检测线粒体自噬特异性的指标，比如
PINK/Parkin
、
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等等
。
这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
基因改变了线粒体自噬相关指标表达，是对其它结果（如形态学）的进一步确认，也是下一步的起点。
第二层：具体那条通路或者途径发挥作用（依赖于哪种方式）？
承接上一层结果，
我们知道细胞凋亡有多种途径或者方式（比如
Caspase-9
、
FAS
和
BCL2
、
BAD
等），类似的细胞铁死亡也有几种方式（如铁离子、脂质过氧化和谷胱甘肽等），而线粒体自噬也有几种（
PINK1-Parkin
通路、
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等），因此在第一层的基础上就需要
确定到底是哪种方式、通路或者途径，检测手段一般还是以
WB
这些常规方法为主。
这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
基因通过
PINK1-Parkin
途径（而非
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等）促进线粒体自噬，当然如果
PINK1-Parkin
途径在
A
基因促进线粒体自噬中发挥非常高的占比，那我们可以说
A
基因依赖于
PINK1-Parkin
途径（而非
FUNDC1
和
BNIP3/NIX
等）促进线粒体自噬。
承接上一层结果，既然确认了
A
基因激活
PINK1-Parkin
途径，那
A
基因具体是如何激活这条通路的呢？
一般情况下我们就要做免疫共沉淀、
ChIP-Seq
、
RIP-Seq
、
RNA pulldown
等实验了（
具体的实验要根据
A
的分子特性来选择，比如
A
的生化特性和细胞定位、结构域分析等等
），这些实验大致分“
筛选和验证
”两部分，所以筛选部分一般是测序等高通量组学方法，验证部分一般是
WB
、
PCR
等低通量手段，筛选的一般原则是“
1
）哪些靶点与
PINK1-Parkin
途径有关；
2
）能解释
A
基因激活
PINK1-Parkin
途径的作用”，当然最好的就是
A
基因直接调控
PINK1-Parkin
，不过多数情况下都筛选不到，这样就需要在
A
和
PINK1-Parkin
之间再找一个
B
分子，即
文献报道
B
如何调控
PINK1-Parkin
，而数据显示
A
可能调控
B
，所以
A
可能通过
B
调控
PINK1-Parkin
通路。
一般情况下，
B
可能会有很多个：
B1
、
B2
、
B3
……，所以就还需要进一步验证，比如对
A
进行免疫共沉淀（
Co-IP
）
+
质谱筛选到
B1
、
B2
、
B3
，验证就反过来做
B1
、
B2
、
B3
与
A
的
Co-IP
。需要注意的是：
如果我们说
A
通过
B2
激活
PINK1-Parkin
途径，到这里还不够，还需要做挽救实验，把
B
敲掉（或者阻断）后，
A
激活
PINK1-Parkin
途径的作用是不是被大大降低，甚至是完全没有了？
反之，把
A
敲掉（或者阻断）后，
B
激活
PINK1-Parkin
途径的作用是不是被大大降低，甚至是完全没有了？
（
这里大家思考一下为什么还要把
A
敲掉或者阻断
）。
同样的道理，我们就说
A
依赖于
B
激活
PINK1-Parkin
途径，这一步完成后可以得到的初步结论是：
A
通过（依赖于）靶点
B
激活
PINK1-Parkin
途径，下面一个问题是：
A
是如何影响靶点
B
的？
承接上一层结果，既然
A
通过靶点
B
发挥作用，而
B
在文献中可以激活
PINK1-Parkin
途径，那
A
是如何影响
B
蛋白的呢？（
其它方式作用，比如
A
影响
B mRNA
等就不展开说了，是一个道理。
）既然我们发现
A
和
B
是两个蛋白相互作用，那就考虑蛋白层面的影响了，所以我们先看
A
对
B
蛋白表达的影响，还是做
WB
看总蛋白就行；假如我们发现
A
沉默后，
B
的蛋白总量减少了，那我考虑是不是
A
影响了
B
蛋白的稳定性（
由于
B
蛋白的产生是
mRNA
翻译的结果，而前面并没有考虑蛋白
A
与
B mRNA
的结合影响，所以这里不探索，但不排除有影响
）。
到蛋白稳定性大家就熟悉了，先做一个半衰期实验，
发现
A
蛋白沉默后
B
蛋白在细胞内的半衰期缩短了，就可以考虑
A
可能是提高
B
蛋白稳定性的，那影响稳定性的原因有哪些呢？
多泛素化介导的蛋白酶体途径降解、溶酶体介导的蛋白降解等等，下面就做两个：
