间充质干细胞治疗急性肺损伤的研究进展

急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是由于感染和非感染等直接或间接因素导致肺部免疫功能紊乱，大量白细胞聚集，促炎因子释放，造成肺内皮细胞和上皮细胞损伤，肺泡膜完整性破坏。临床表现为呼吸窘迫、难治性低氧血症、非心源性肺水肿，可进展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrom, ARDS） 。目前ALI的传统治疗方法包括：肺保护性机械通气、保守性液体治疗等 ，但均未从根本上修复肺上皮细胞与肺内皮细胞的屏障功能障碍、改善肺功能、降低病死率。

目前干细胞治疗肺损伤成为新热点，尤其是间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）治疗。与胚胎干细胞和多功能干细胞相比，MSC治疗无须担心形成畸胎瘤、免疫排斥反应与伦理问题等 。另外，MSC易于获取，具有自我增殖、多向分化、旁分泌等多种功能，为其治疗疾病提供强大潜能。大量基础研究表明，MSC对感染型 和非感染型 肺损伤均有治疗作用，能有效改善肺部炎症及肺上皮细胞及肺内皮细胞的损伤，从而提高肺顺应性。截至2015年8月已有22项MSC治疗肺部疾病相关临床研究在clinicaltrials.gov注册，其中5项关于MSC治疗ALI/ARDS（NCT02444455、NCT02112500、NCT01775774、NCT02097641、NCT01902082），但目前的临床研究仅观察到某些炎症因子的下降，尚未发现明显的疗效。本文旨在综述MSC的特性、常用MSC来源、使用方法、MSC治疗ALI的潜在机制及临床运用潜能。

1.1　定　义

2006年召开的国际细胞治疗协会定义MSC具有以下特点： ① 标准培养条件下可黏附在塑料表面； ② 表达CD73、CD90和CD105，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a和CD19、HLAⅡ； ③ 在体内具有分化为骨、软骨和脂肪细胞的能力。

1.2　起　源

关于MSC的起源众说纷纭，Takashima等 认为MSC起源于神经上皮，Gotts和Matthay 认为在发育阶段MSC具有不同的起源。

1.3　来　源

MSC几乎可以取材于所有组织，如骨髓、脂肪、软骨、胎盘、脐带血等组织 ，Peng 等 研究发现，喉黏膜组织可以培养出MSC，牙周膜干细胞具有MSC的特性 。

1.4　分　化

在特定生理和实验条件下，MSC可分化为特定的细胞，在不同微环境下其分化能力不同 。Ullah等 发现MSC可分化为中胚层源的骨、软骨、脂肪、心肌、骨骼肌、平滑肌，外胚层源的神经元细胞，以及内胚层源的肝细胞、胰岛β细胞等。MSC的多向分化功能为其治疗作用也提供强大潜能。Gong等 发现MSCs可以分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞和内皮细胞 ，若MSC能再生修复损伤的肺泡上皮细胞与肺内皮细胞，则能有效治愈ALI，但具体作用及机制仍有待进一步探索。

1.5　免疫特性

人型MSC不表达MHCⅡ、CD40、CD80和CD86，仅表达MHCⅠ，但MHCⅠ不参与机体的免疫应答 。但是Dimarino等 新研究发现MSC不再具有“免疫特权”，在炎症环境下MSC上调MHCⅡ，MHCⅡ使T细胞识别外源性抗原表位，以区分自身与异体 。目前已完成的同种异体MSC移植治疗肺部疾病Ⅰ期临床试验 均未出现患者发生严重免疫排斥反应。

大量动物实验表明MSC对多种类型ALI有治疗作用：MSC可以改善博来霉素导致的肺纤维化，明显改善内毒素 、大肠杆菌 、盲肠结扎穿孔 、机械通气 、盐酸 等导致的肺损伤，修复肺上皮与表皮屏障功能，降低肺泡灌洗液中炎症因子、炎症细胞、蛋白等渗漏，降低肺干/湿比与伊文思蓝蛋白的渗透，提高中性粒细胞和巨噬细胞对细菌的吞噬能力，改善氧合指数和肺顺应性。

2.1　植入和归巢

外源性给予MSC后，MSC会向炎症损伤处或破裂的血管植入与归巢 。Németh等 通过MSC示踪方法，静脉注射荧光标记的MSC，发现肺部最先出现荧光，然后依次在肝、脾、肾等其他组织中检测到，但24 h后在肺中荧光标记的MSC基本消失。MSC向损伤部位植入与归巢的机制复杂，目前研究认为主要有以下几种：

2.1.1　基质细胞衍生因子1（stromal cellderived factor, SDF-1）及其受体趋化因子受体-4（chemokine receptor type 4, CXCR-4）的作用

SDF-1及其CXCR-4被认为是MSC植入归巢最重要的机制 。IL-6、干细胞生长因子等细胞因子处理MSC，可以增加CXCR-4表达，促使MSC植入归巢；低氧促进CXCR-4表达，增加MSC植入 ；重组MSC过表达CXCR-4，增加其植入归巢 。

2.1.2　黏附因子的直接作用

归巢要求MSC可以黏附在内皮细胞上，并能在内皮细胞间迁移，以到达靶位点，这与大量黏附因子相关。MSC通过保护黏附连接点以及抑制白细胞黏附因子的表达，直接与肺内皮细胞相互作用，从而保护内皮细胞屏障完整性 。

MSC注射部位、时间、方式、剂量、供体年龄、培养条件及损伤情况均会影响MSC的植入与归巢。采集新鲜MSC、保持有利于归巢受体的表达、控制培养条件等方式可提高MSC的植入与归巢 。

尽管大剂量MSC移植，但是植入效率一直很低，一些学者认为植入不再是MSCs发挥作用的重要机制，Matthay等 认为MSC植入仍具有研究价值。MSC更多的植入，向损伤部位归巢，分化为相应细胞进行组织修复，仍是研究的一个重点。

2.2　免疫调节

Hall等 腹腔注射Ly6G抗体消耗中性粒细胞后，发现MSC对小鼠盲肠结扎穿孔模型的治疗作用消失，说明MSC具有调节中性粒细胞吞噬细菌的能力。Németh等 研究发现MSC可提高成熟T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell, NK细胞）缺失型小鼠盲肠结扎穿孔模型生存率，但对单核细胞和巨噬细胞缺失型小鼠无保护作用。他们发现MSC通过分泌前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）作用于巨噬细胞膜上受体EP2、EP4，促进巨噬细胞从M1型转化为M2型，增加巨噬细胞分泌IL-10，从而减少中性粒细胞迁移到组织，减轻组织损伤。可见MSC具有免疫调节功能，依赖于细胞间接触或旁分泌。

近期研究发现不同炎症环境中，MSC抑制免疫细胞能力不同，炎症反应的状态决定了MSC的免疫调节方向。机体处于炎症亢进时，MSC抑制炎症；机体发生免疫抑制时，MSC则增强免疫反应。在体内动态调节免疫反应平衡是MSC发挥免疫抑制功能的重要条件 。

2.3　降低肺水肿

肺内皮细胞和肺上皮细胞屏障功能障碍，肺泡液清除率降低，从而导致肺泡水肿，是肺损伤的主要发病机制之一 。大量研究证明MSC可以降低内皮细胞和上皮细胞通透性，提高肺泡液清除率。该作用与MSC旁分泌密切相关，尤其是角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor, KGF）和促血管新生蛋白因子-1（angiopoietin-1, Ang-1）。

2.3.1　KGF的作用

Lee等 研究表明MSC可以修复内毒素导致的肺损伤肺部体液平衡紊乱，最可能的机制是MSC分泌KGF，上调钠通道相关基因。采用干扰RNA（small interfering RNA, si-RNA）沉默KGF表达后，肺泡液清除率降低80%。Chen等 在MSC内过表达KGF，可提高MSC治疗内毒素导致的小鼠ALI作用，可能是KGF增加了Ⅱ型肺上皮细胞的增殖和肺表面活性物质的合成。

2.3.2　Ang-1的作用

有研究 发现MSC而不是Ⅱ型肺泡细胞分泌Ang-1。在炎症因子混合液中，MSC可分泌更多Ang-1，增强MSC的疗效，si-RNA阻断Ang-1转录后，MSC降低上皮细胞通透性作用消失。Ang-1是血管生成素受体的配体，与NF-κB有关，阻止肌动蛋白纤维形成，维持紧密连接蛋白-18，从而作用于上皮细胞 。

2.4　抗菌作用

MSC通过旁分泌抗菌肽（cathelicidin antimicrobial peptide, CAP-18/LL-37）和上调抗菌蛋白-脂运载蛋白-2表达直接发挥抗菌作用，也可通过调节巨噬细胞等细胞的吞噬功能间接发挥抗菌作用。在MSC治疗感染引起的肺损伤模型如羊绿脓杆菌肺损伤模型 、小鼠大肠杆菌肺损伤模型 、小鼠盲肠结扎穿孔模型时 ，均发现肺泡灌洗液、外周血、腹腔灌洗液中的细菌明显减少，表明MSC具有抗菌作用。

2.4.1　直接抗菌作用

Krasnodembskaya等 研究发现MSC分泌LL-37，拮抗LL-37后MSC抗菌作用下降。 Gupta等 发现脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和TNF-α等炎症刺激时MSC上调脂运载蛋白-2的产生，脂运载蛋白-2结合细菌的铁运载体，限制细菌铁的使用，从而增强细菌清除率，拮抗脂运载蛋白-2，MSC抗菌作用消失。

2.4.2　间接抗菌作用

Mei等 实验显示，MSC间接调节宿主巨噬细胞的吞噬作用，通过分析盲肠结扎穿孔后28 h小鼠脾脏组织的基因表达，MSC能够下调炎症通路相关基因（如IL-6、IL-1受体和IL-10），上调细菌吞噬的相关基因（如在巨噬细胞和单核细胞中介导吞噬作用的Fc 受体、NC细胞信号通路、抗原提呈相关信号通路） 。

2.5　线粒体转移与微泡、微管形成

Islam等 研究发现MSC通过转移线粒体到肺泡从而减轻肺损伤。MSC钙依赖性形成表达连接蛋白43（connexin43, CX43）的微管和微泡，上皮细胞吞噬微泡，有利于线粒体的转移。转移的线粒体仍具活性，可增加肺泡ATP。当注入线粒体失活、CX43功能缺失或基因敲除的MSC，则不能改善内毒素导致的小鼠肺损伤。

Zhu等 提取人骨髓MSC的微泡注射到内毒素导致的肺损伤小鼠气管内，发现肺水肿和肺蛋白渗漏明显降低。采用KGF的si-RNA预处理MSC后，提取的微泡对肺损伤的治疗作用消失。说明MSC分泌表达KGF的微泡，可改善小鼠内毒素型肺损伤。

微泡作为新发现的细胞间的运输方式，可能成为以后MSC治疗新方向。

Chang等 报道一名ARDS患者实施气管内移植同种异体人脐带血MSC，移植后3 d患者精神状态、肺顺应性、氧合指数和胸片均可见明显改善，但最终死于反复的肺部感染。Weiss等 对62例慢性阻塞性肺病患者随机静脉注射MSC或安慰剂，随访2年，无毒性反应、死亡等不良事件发生，但除早期外周血中C反应蛋白治疗组有明显下降，在肺功能和生活质量方面治疗组与安慰剂组比较，差异无统计学意义。Chang等 对9例存在支气管肺发育不良高风险的新生儿气管内移植同种异体人脐带血MSC，Zheng等 对12例ARDS患者进行MSC移植，两项临床试验均未有毒性反应、死亡等不良事件发生，但治疗组病情未见明显改善。虽在肺部疾病临床试验中未见MSC明显疗效，但在其他疾病的临床试验中，MSC颇有疗效：6例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者局部心肌内注射MSC，18个月后与治疗前比较局部纤维化减少，新生血管和肌细胞增加，左室结构和功能改善（NCT00587990）；53例急性心肌梗死后再灌注患者随机静脉注射MSC或安慰剂，2年内MSC治疗组心律失常发生率低，肺功能和左室射血分数有明显改善（NCT00114452）。