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Nature | SCF-FBXO31识别并降解C端酰胺标记的蛋白

BioArt · 公众号 · 生物 · 2025-02-13 17:30

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撰文 | 一只鱼

在正常的细胞稳态过程中，未折叠和错误定位的蛋白质会被识别并清除，以防止有毒副产物的积累。当蛋白质稳态在衰老、神经变性或细胞应激期间受到干扰时，蛋白质会通过活性代谢物积累多种形式的化学损伤。这些化学修饰可能是蛋白被选择性清除的识别信号，然而，许多化学修饰在蛋白稳态中的作用仍不清楚。

近日，来自瑞士联邦理工学院的 Jacob E. Corn 研究团队在 Nature 上发表题为 C-terminal amides mark proteins for degradation via SCF–FBXO31 的文章，发现携带C端酰胺的蛋白（CTAP）会迅速被细胞清除，并通过CRISPR筛选鉴定了FBXO31是C端酰胺的识别因子。FBXO31是SKP1-CUL1-F盒蛋白（SCF）泛素连接酶SCF-FBXO31的底物受体，对CTAP进行泛素化，导致通过蛋白酶体降解。FBXO31有一个保守的结合口袋，能够选择性结合携带C端酰胺的肽，这种机制促进了氧化应激后形成的内源性CTAP的结合和降解。

为了研究化学修饰对蛋白降解的作用，他们准备了一系列半合成的荧光报告子并将其转入到人类细胞中检测其稳定性。通过固相肽合成，他们生成了一组携带特定修饰的肽，这些修饰代表不同类型的蛋白质损伤：通过氧化或错误掺入导致的酪氨酸修饰（L-3,4-二羟基苯丙氨酸，L-DOPA），羰基化（N(6)-己酰基赖氨酸），高级糖基化终产物（N(6)-羧甲基赖氨酸），氨甲酰化（同脲），以及形成一级酰胺的主链裂解（C端酰胺）。通过Sortase-A介导的连接，将这些肽连接到重组荧光蛋白的C末端，生成了一组化学修饰的报告子。然后检测荧光信号的变化，他们发现 携带C端酰胺的蛋白 （ CTAP ）会快速降解。为了找到细胞内降解CTAP的机制，他们利用全基因组CRISPR筛选来寻找CTAP降解所必需的基因，鉴定到了 FBXO31 ，该基因编码 SCF泛素连接酶 组装的接头蛋白，在细胞中敲降或敲除FBXO31可以抑制CTAP降解。因此， SCF-FBXO31介导CTAP降解 。

如果FBXO31可以检测C端酰胺，那么它需要对广泛的C端序列进行检测，同时保持对酰胺比羧酸更高的选择性。此外，它不能简单地与任何一级酰胺基团结合，因为这些基团几乎存在于所有蛋白质的天冬酰胺和谷氨酰胺侧链中。因此，他们通过体外结合研究来确定FBXO31的底物范围，发现 FBXO31与多种C端酰胺具有高亲和力和选择性，而对于未修饰的C端和侧链酰胺则不具有这种特性 。常规的未修饰C末端降解标记通常通过其各自泛素连接酶上的正电荷被识别。之前的结构研究显示，FBXO31与来自Cyclin D1的未修饰C端肽形成的复合物中，存在一个底物结合口袋，这个口袋在Asp334处带有负电荷，因此可能不利于未修饰的C端结合。为测试仅仅去除带负电荷的C末端是否是CTAP选择性的基础，我们测量了FBXO31对各种修饰肽的结合。将带负电荷的C末端（-COOH）替换为醇（-CH ₂ OH）或用甲基酯（-COOMe）封闭后，并未诱导FBXO31结合，因此， FBXO31对C端酰胺的选择性可能源于羧酸的电荷排斥和与其底物的一级酰胺的直接相互作用 。

在体内，大多数分泌的肽类激素通过肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶（PAM）处理，利用铜催化的羟基自由基攻击和随后的末端甘氨酸裂解，生成缩短的C末端酰胺化肽。在体外，羟基自由基可以通过类似的机制触发肽键裂解，产生C末端酰胺片段。因此，他们假设通过FBXO31降解CTAP可以消除由分泌蛋白错误运输或氧化损伤引起的蛋白质片段。Cullin环连接酶（CRLs）是最大的泛素连接酶家族，拥有超过300种不同的组装形式，包括SCF-FBXO31。他们使用一种新开发的基于活性分析的方法（CRL-ABP）对K562细胞在氧化应激后的泛素CRL复合物的组成和底物进行了测定。通过亲和纯化活性CRL复合物并进行质谱分析，确认SCF-FBXO31是第二最强的应激激活的CRL，并且CRL相关的蛋白质组发生了广泛的重组，266种蛋白质显示CRL靶向增加。其中，包括K562细胞中表达的所有四种血红蛋白亚基（HBA, HBE, HBZ和HBQ），这些亚基在体内和体外可以形成CTAP。因此， FBXO31可以响应细胞胁迫并识别响应的内源底物 。

FBXO31的功能丧失突变会引起临床上的智力障碍，一些 双瘫性痉挛性脑瘫 患者中存在一种主动性新发突变 D334N ，这种突变会消除FBXO31底物结合口袋中的负电荷，他们发现这种突变的FBXO31会结合一些新的底物，这些新底物的C端序列都不能被野生型FBXO31结合，这些新底物中包含一些至关重要的蛋白，如SUGT1。因此， D334N突变会重塑FBXO31的底物，使得一些重要蛋白被降解 ，这可能也是该突变为显性的原因。

SCF-FBXO31识别并降解CTAP

总的来说，这项研究揭示了FBXO31-SCF识别底物的信号，CTAP可能代表了一类尚未被充分研究的修饰氨基酸降解标记，这类标记可能是细胞对化学损伤蛋白质进行选择性且广泛监控的基础。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08475-w

制版人：十一

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