Nature | 利用CRISPR–Cas9筛选鉴定神经干细胞衰老的调节因子

撰文| 阿童木

成年哺乳动物大脑中存在多个神经干细胞（NSC）高活性区域，这些区域能够生成新生神经元并修复因中风或脑损伤而受损的脑组织【1】。研究发现，最活跃的NSC活性区域位于大脑侧脑室的室管膜下区（SVZ），该区域的NSC每天可在年轻小鼠中产生数千个新生神经元。SVZ区域包含一组静止的NSC（qNSCs），它们能够转化为活化的NSC（aNSCs），后者进一步生成前体细胞，前体细胞再从生态位迁移到嗅球，并在嗅球中分化为神经元【2】。然而，在衰老的大脑中，NSC的活化和生成新生神经元的能力显著受损，这可能导致感官和认知功能的缺陷【3】。

鉴定NSC活化的调控基因对于临床上干预并抑制衰老大脑的退行性缺陷至关重要。已有多项研究表明，包括BMP、P16和IGF-1等信号通路和转录调控因子在内的多种遗传干预措施能够改善衰老NSC的活化能力【4,5】。然而，这些研究通常大多聚焦于一个或少数几个基因，通量有限，因而我们对调控衰老NSC活性和功能的途径仍缺乏系统性认知。

目前，许多研究虽致力于探索改善衰老细胞功能的遗传干预措施，但面临的主要挑战在于如何在哺乳动物中建立稳定可靠的高通量遗传筛选体系。衰老不仅在细胞水平发生，也在整体生物体水平上体现，因此，重要的是在衰老生物体的细胞中进行体外筛选，同时能够拓展到衰老组织中进行体内筛选。目前已经开发出几种针对体外多种表型的CRISPR–Cas9全基因组筛选技术，例如应用于Werner综合症和Hutchinson-Gilford早老症模型的干细胞模型等【6】。然而，针对正常衰老细胞的遗传调控因子进行高通量遗传筛选，仍是一个巨大挑战。不仅如此，哺乳动物体内遗传筛选技术仍不成熟，目前的研究大多集中于发育期、年轻组织或癌症相关的领域。因此，开发针对老年哺乳动物细胞和组织的CRISPR–Cas9筛选平台，将有助于发现此前未知的基因调控机制，从而恢复老年个体的细胞活性和组织功能。

近日，斯坦福大学Anne Brunet实验室在Nature杂志发表了题为CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells的研究文章，通过建立体外和体内高通量CRISPR-Cas9筛选平台，作者发现超过300个基因的敲除可恢复衰老小鼠神经干细胞（NSC）的活化和迁移，包括与调控纤毛结构和葡萄糖摄取等相关的基因。作者将Slc2a4（编码GLUT4葡萄糖转运蛋白）确定为主要靶点，并发现NSC中的葡萄糖摄取增加会潜在导致其活化能力和分化功能的下降，而短暂的葡萄糖饥饿能有效恢复NSC活性。本研究揭示了GLUT4及葡萄糖代谢在衰老NSC活化和功能调控中的核心作用，并展示了一种通过调节葡萄糖摄取和代谢来改善衰老大脑再生潜力的新策略。

为了系统性识别衰老过程中影响NSC活化的基因，作者通过CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选技术，对来自年轻和衰老小鼠的NSC原代培养物进行了全基因组筛选（图1）。总体上，全基因组筛选识别到了654个基因敲除可以增强NSC活化，1386个基因敲除抑制了NSC活化。其中，143个基因敲除能够同时增强年轻和老年NSC的活化，210个基因敲除特异性增强年轻NSC的活化，301个基因敲除特异性增强老年NSC的活化。此外，GO分析表明，特异性增强衰老NSC活化的基因与纤毛组织结构、RNA结合蛋白和葡萄糖运输等有关。

图1 利用CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选鉴定NSC活化的调控基因

为了验证基因敲除是否能够在体内增强NSC功能，作者开发了一种基于CRISPR-Cas9技术的体内筛选平台，用于识别能够增强衰老小鼠NSC功能的基因敲除。研究通过向老年小鼠的侧脑室中注射表达sgRNA的慢病毒，感染位于SVZ区域内的NSC，5周后NSC活化导致敲除的病毒感染细胞迁移到嗅球中。接下来，作者在老年Cas9小鼠中进行了3次独立的靶向筛选，以确定能够增强NSC活化并促进其嗅球迁移的基因，结果显示与纤毛结构、葡萄糖摄取和阿尔茨海默病相关的基因敲除能够显著提高老年NSC的活化和功能。因此，通过新开发的体内基因筛选技术并结合体外筛选，作者明确了与纤毛、糖代谢及核糖核蛋白结构等相关的基因调控了衰老NSC的活化与迁移。

分析通过筛选得到的数据后，作者发现无论是在体内还是体外条件下，Slc2a4 基因（编码GLUT4蛋白）敲除是改善衰老NSC活性和功能的最为有效的基因敲除之一。GLUT4 是一种依赖胰岛素的葡萄糖转运蛋白。此前研究表明，葡萄糖代谢与年轻 NSC 的自我更新、生存和分化有关，但葡萄糖代谢在衰老 NSC 中的作用尚不清楚。作者因此探究了是否抑制 SVZ 区域的 GLUT4 能够增强衰老NSC 生成新生神经元的能力（即嗅球中的神经发生）。首先，作者发现随着年龄的增长，GLUT4在老年NSC中的表达水平有所上调，尤其是在静止状态的神经干细胞（qNSCs）中，且GLUT4的上调是潜在导致衰老NSC功能下降的原因之一。而通过抑制GLUT4的表达后，不仅NSC的数量增加，其活性和分化潜力也得以增强，进一步推动了神经再生。其次，除了基因调控外，作者还探索了限制葡萄糖摄取的其他方法，如通过短暂的葡萄糖饥饿或使用类似于葡萄糖的化合物来干扰其代谢。结果显示，外源性限制葡萄糖摄取同样能够激活衰老NSC的功能。因此，降低NSC中的葡萄糖摄取能够促进NSC从静止状态转变为活性状态，增强其再生能力。

综上所述，本研究开发了高通量CRISPR-Cas9筛选平台，针对调控衰老小鼠NSC活性的基因进行了体外和体内筛选，共鉴定到300余个基因的敲除可以恢复NSC活化。在体内筛选中，作者确认了以Slc2a4（编码GLUT4葡萄糖转运蛋白）为代表的24个基因敲除能够增强老年大脑NSC活化，并发现NSC中葡萄糖摄取增加可能是导致NSC活化能力下降的原因之一，短暂的葡萄糖饥饿则能有效恢复其活化能力。本研究为系统性鉴定改善衰老NSC功能的基因干预措施提供了新的平台，并证明了葡萄糖摄取与代谢是影响NSC活性与功能的关键因素。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07972-2

制版人：十一

1. Gage, F. H. & Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron 80, 588–601 (2013).

2. Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M. & Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 97, 703–716 (1999).

3. Navarro Negredo, P., Yeo, R. W. & Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell 27, 202–223 (2020).

4. Chaker, Z., Aid, S., Berry, H. & Holzenberger, M. Suppression of IGF-I signals in neural stem cells enhances neurogenesis and olfactory function during aging. Aging Cell 14, 847–856 (2015).

5. Molofsky, A. V. et al. Increasing p16^INK4α expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing. Nature 443, 448–452 (2006).

6. Wang, W. et al. A genome-wide CRISPR-based screen identifies KAT7 as a driver of cellular senescence. Sci. Transl. Med. 13, eabd2655 (2021).

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