肺结核 (tuberculosis, TB) 至今仍是高居全球致死率第一的传染性疾病，也是全球主要的传染病威胁之一。目前唯一获批的结核疫苗是卡介苗（BCG）。尽管BCG对婴儿的结核脑膜炎和播散性结核病具有保护作用，其对青少年和成人结核病的保护效果不尽如人意，远低于其他疫苗（如脊髓灰质炎和麻疹疫苗）的90%保护率。阻碍结核疫苗开发的挑战主要有两点：（1）缺乏廉价且与人类关联性强的动物模型；（2）缺少确凿的生物指标(如免疫保护标志)来评价疫苗保护效果。尽管在非人灵长类模型和免疫保护指标方面已有进展，但如果能开发出一种受控人类感染实验模型（controlled human infection model, CHIM），将为评估疫苗效力提供重要补充。受控人类感染实验模型，也称为人体挑战实验 (human challenge model)，是推进疫苗研发和评估治疗效果的重要工具。该方法通过在志愿者中人为接种病原菌，从而测试疫苗或治疗候选物的疗效。相比于传统动物实验与自然感染，人体挑战实验有诸多优势: (1) 更精准地获得人体免疫反应，(2)更详尽地刻画人体感染初期反应，(3)可以控制诸多变量，如感染率，感染时间，病原体的遗传背景差异、感染剂量的变化、接触时间的不确定性以及患者的合并症问题。凭借这些优势，人体挑战实验已成功应用于多种FDA批准的疫苗和疗法开发，比如抗霍乱疫苗，抗疟疾疫苗和抗新冠药物等。但种种安全原因限制了人体挑战实验助力抗结核疫苗的研发。如何实现人体挑战实验在结核病的应用是一个重要的课题。2025年1月10日，哈佛大学公共卫生学院免疫与传染病系的Eric Rubin与Sarah Fortune团队，联合康奈尔大学威尔医学院的Sabine Ehrt与Dirk Schnappinger团队，在Nature Microbiology发表了题为Engineered Mycobacterium tuberculosis triple-kill-switch strain provides controlled tuberculosis infection in animal models的文章。第一作者为王欣博士，苏宏伟博士，Joshua Wallach与Jeffrey Wagner博士。该研究通过基因工程在结核杆菌内实现了三种机制独立的“自杀开关”，得以控制结核杆菌的生长、感染与快速死亡，为伦理安全的结核人体挑战实验奠定坚实的基础。
人体挑战实验必须符合“无论如何不能伤害志愿者” (primum non nocere) 的伦理原则。对于结核病尤其如此，因为常规治疗结核感染需要服用长达6个月的抗生素，为志愿者带来不必要的负担。成功的结核人体挑战实验需要设计一种符合安全伦理标准的减毒结核分枝杆菌（Mtb）挑战菌株。我们认为该菌株需要达到以下标准: (1)该菌株需在人体能建立感染并有效复制；(2) 需要有一套基因调控系统来控制细菌的存活与诱导细菌的快速死亡; (3) 该菌株的调控系统应具有极低的突变逃逸率来保证安全。我们将突变逃逸率的目标设定为每代基因组突变率低于10⁻¹²。为实现这些目标，作者在Mtb 的野生型H37Rv菌株中设计并集成了三套独立的“自杀开关 (kill switch) ”基因调控系统来调控细菌生长与死亡。前两种“自杀开关”是受四环素负调控的噬菌体裂解素 (Lysin) 系统。在存在外源四环素的情况下，D29裂解素和L5裂解素被分别激活，从而导致结核杆菌裂解死亡。反之，在没有外源四环素的情况下，裂解素表达被抑制，从而结核杆菌存活。第三种”自杀开关”是受甲氧苄啶负调控的蛋白质降解系统。作者把结核杆菌的必需代谢酶NadE与甲氧苄啶负调控的降解子 (degron) 融合。在不存在外源甲氧苄啶的情况下，融合的代谢酶NadE被降解导致结核杆菌死亡；反之结核杆菌存活。作者把成功构建的减毒结核杆菌菌株成为三自杀开关菌株 (Triple-Kill-Switch strain, TKS strain)。在成功构建菌株后，作者首先对TKS菌株的自杀开关调控做了一系列体外实验的评估。在允许菌株生长的条件下（无外源四环素与甲氧苄啶），TKS菌株的生长速率，菌体形态和抗生素敏感性与野生菌株并无显著差别。在诱导菌株死亡的条件下（有外源四环素与甲氧苄啶），TKS菌株迅速死亡，在11天内从106 CFU/mL降为 <3 CFU/mL。在只激活其一自杀开关下，作者对逃逸细菌做了全基因组测序，分别刻画了可能导致逃逸一个自杀开关的基因突变。在激活三个自杀开关下，没有发现逃逸细菌，体外的每代基因组突变逃逸率低于观测极限（10-10），理论计算为10-14。作者通过一些列体内实验对TKS菌株的安全性与致病性进行评估。在野生型C57BL/6老鼠中，在给于外源四环素与甲氧苄啶下，TKS菌株能建立正常的肺部感染，28天内从肺部102 CFU攀升至104 CFU。在撤除四环素与甲氧苄啶后，TKS在老鼠体内死亡，56天内达到肺部无菌 (< 1 CFU)，并在112天后无复发。老鼠体内抗结核的T细胞免疫反应随着菌株死亡而消退。为了测试清除后的菌株在免疫缺陷环境下是否复发，作者测试了Rag-/-和重症联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠，确认了在清除后的70天后即使存在四环素与甲氧苄啶也在多个器官中没有复发。综上所示，为了实现伦理安全的肺结核的人体挑战实验，该研究通过基因工程的手段构造了安全的人体挑战实验结核菌株。该研究通过在肺结核菌株中成功引入了三个互相独立的“自杀开关”，从而控制细菌生长并诱导细菌快速死亡。这三个“自杀开关”的极低逃逸突变率，确保了这一菌株使用的安全性。一系列的动物实验确认了该菌株的感染性和安全性符合了人体挑战实验的预期。在同期的另一篇文章中，匹兹堡大学JoAnne Flynn团队联合康奈尔大学威尔医学院的Sabine Ehrt与Dirk Schnappinger团队，发表了题为A BCG kill switch strain protects against Mycobacterium tuberculosis in mice and non-human primates with improved safety and immunogenicity的文章。第一作者为Alexander Smith博士，苏宏伟博士与Joshua Wallach。该研究利用基因工程改造卡介苗，通过添加或去除小分子化合物诱导卡介苗的自裂解，进而实现对细菌生与死的控制，该菌株相比于野生型卡介苗在小鼠和非人灵长类感染模型中展现出更好的安全性与有效性，为后续解析宿主免疫保护标志物以及临床应用提供重要的工具菌株。
卡介苗（BCG）作为目前唯一获批用于预防结核病感染的古老疫苗，已经使用超过100年。更安全高效的下一代结核病疫苗的研发迫在眉睫。临床上，卡介苗通常经皮内注射的方式接种，最新的研究表明，静脉注射的方式接种卡介苗在非人灵长类动物模型中可以成功预防肺结核感染【1】。然而静脉注射的接种方式给安全性带来了巨大的挑战，特别是考虑到HIV病人等免疫缺陷人群，静脉注射可能带来致命的感染风险。通过基因工程改造卡介苗提高其有效性与安全性，将为后续疫苗的开发提供重要的工具菌株。研究人员认为通过小分子化合物精确控制细菌死活可以提高卡介苗安全性。于是作者尝试通过四环素诱导表达系统控制分枝杆菌噬菌体裂解素 (Lysin) 来实现对细菌的可控裂解。可控诱导裂解具有两方面的优势：（1）提高卡介苗的安全性，在建立免疫后可以通过添加或去除小分子化合物诱导细菌死亡；（2）细菌裂解可以释放更多的胞内抗原，进而提高卡介苗的免疫原性。作者采用了与上一篇文章类似的基因工程方法，首先分别通过Tet-on和Tet-off两种四环素诱导表达系统控制分枝杆菌噬菌体D29和L5的lysin operon，构建了Tet-on double lysin (BCG-TetON-DL)菌株和Tet-off double lysin (BCG-TetOFF-DL) 菌株。并且通过一系列体外表型实验证明atc可以在TetON和TetOFF系统中稳定控制噬菌体毒素lysin的表达，实现对细菌死活的精确控制。此外作者在BMDM中诱导BCG-TetON-DL裂解使得BMDM可以分泌更多的促炎症细胞因子（TNF，IL-12，IL-6），证明胞内裂解卡介苗诱导更强的免疫反应。其次，作者通过一系列体内实验验证自失活菌株的安全性与有效性。（1）在野生型C57BL/6小鼠中静脉注射建立免疫后，通过在小鼠食物中添加或者去除含有doxycycline的食物分别控制BCG-TetON-DL菌株和BCG-TetOFF-DL菌株在小鼠体内的生长以及裂解。（2）静脉注射的方式在免疫缺陷（SCID和Rag-/-）小鼠模型建立感染112天之后，BCG-TetOFF-DL组别中的小鼠仍健康，而野生卡介苗的小鼠全部死亡，验证了double lysin菌株相比于卡介苗菌株的安全性更好。（3）通过免疫保护实验证明BCG-TetON-DL和BCG-TetOFF-DL菌株在小鼠模型中保护效率与WT卡介苗相当。疫苗组在小鼠肺组织中诱导了 效应记忆CD4 T细胞，CD8 T细胞，多功能CD4 T细胞，肺组织驻留CD4 T细胞和CD153+ CD4 T细胞，可能是潜在的免疫保护因子。最后，作者利用BCG-TetOFF-DL菌株在非人灵长类感染模型进行实验，首先验证可以通过doxycycline控制该菌株在猴体内的生长与死亡。其次通过免疫保护实验证明BCG-TetOFF-DL在猴感染模型中提供极佳的免疫保护效果，8只猴子中有6只被完全保护，而WT卡介苗组的8只猴子中只有2只被完全保护。同样，免疫反应检测表明BCG-TetOFF-DL和WT卡介苗均在猴肺气道和组织内诱导记忆CD4 T细胞。相比于WT卡介苗，BCG-TetOFF-DL菌株诱导丰度更高的CD4 T细胞和细胞因子阳性CD4 T细胞。综上所述，该研究通过基因工程手段改造卡介苗，提高了卡介苗的安全性与有效性，该菌株在猴感染模型中展现出极佳的免疫保护效果，为后续解析结核病的宿主免疫保护标志物提供重要的工具菌株。该菌株降低了静脉注射或者呼吸道黏膜免疫方式的风险，为免疫缺陷人群提供一个更佳的选择。同时卡介苗也是膀胱癌的有效治疗手段，但是约有8%的病人因为副反应无法继续治疗，该菌株也为膀胱癌的治疗提供新的候选菌株。上述两篇文章通过基因工程分别在结核分枝杆菌 (Mtb) 和卡介苗 (M. bovis BCG) 中构建了利用小分子化合物控制细菌生死的菌株。自失活卡介苗菌株在体内、体外可以被四环素精确调控，逃逸突变频率低，在小鼠和猴感染模型中展现出更优的安全性与有效性，为解析宿主免疫保护标志物提供重要的疫苗菌株。TKS Mtb结核菌株在体内、体外被四环素和甲氧嘧啶精确调控，逃逸突变频率极低，在正常小鼠和免疫缺陷小鼠模型中均展现出良好的感染性和安全性，为评估疫苗效果提供了人体挑战实验的工具菌株。两个菌株的开发为后续在动物模型和临床实验中解析宿主的免疫保护标志物打下了重要的工具基础，推进高效安全疫苗的研发进程。苏宏伟博士目前任职于浙江大学动物医学中心，“百人计划”研究员，长期从事结核分枝杆菌药物耐受机制，病原宿主互作机制研究以及新型疫苗的研发，长期招聘博士后，欢迎对结核病相关研究感兴趣的青年人才加入。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41564-024-01913-5
https://www.nature.com/articles/s41564-024-01895-4
制版人：十一
1. Darrah, P.A., Zeppa, J.J., Maiello, P. et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature 577, 95–102 (2020).
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