结直肠癌（CRC）中共生微生物与肠上皮细胞紧密互动是重要可能促进肿瘤发生发展的机制之一，但是CRC中的微生物组-甲基组轴尚未得到系统性研究；
2024年6月5日，南京医科大学基础医学院研究团队于Genome Medicine（IF:10.4）在线发表了题为“结直肠癌微生物组通过影响甲基供体代谢来控制宿主细胞的DNA甲基化Colorectal cancer microbiome programs DNA methylation of host cells by affecting methyl donor metabolism”的文章。
研究旨在阐明结直肠癌（CRC）组织及其相应邻近正常组织中微生物组与宿主细胞DNA甲基化之间的复杂相互作用。
整合了宏基因组测序分析和全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）分析，多维度探究并鉴定了在正常和肿瘤组织中表现出特定微生物类群相关的表观遗传和差异调控的潜在蛋白编码基因和非编码RNA。
结果表明与CRC相关的微生物可能有能力影响结肠上皮细胞中的DNA甲基化模式，从而控制肠道稳态或推动肠道肿瘤发生和发展，为CRC中的微生物组-甲基组轴简介提供重要补充。
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一、背景
结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。CRC的发展涉及遗传突变、表观遗传改变和环境因素之间的复杂相互作用。共生微生物与肠上皮细胞紧密互动，作为环境刺激的重要来源，深刻影响宿主细胞功能。
DNA甲基化是一种主要发生在CpG二核苷酸上的突出表观遗传修饰，它通过影响与肿瘤形成相关的蛋白质结合和染色质结构，在一系列生理和病理生理过程中发挥关键作用。
DNA甲基化模式紊乱与CRC密切相关，因为它们与肿瘤抑制基因的转录抑制和原癌基因的激活有关。
DNA甲基化由甲基转移酶这类酶协调，它们使用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为活性甲基供体。这个过程的复杂性扩展到积极参与一碳代谢的甲基供体，包括叶酸和蛋氨酸循环。
既往的一些研究突出了肠道微生物组和宿主细胞甲基组之间的重要联系。但是CRC中的微生物组-甲基组轴尚未得到系统性研究。
二、数据、方法和研究流程
1）数据：
粪便样本的宏基因组测序数据。
结直肠癌（CRC）患者和健康对照组的粪便微生物组数据。
肿瘤组织和匹配的邻近正常（AN）组织的16S rRNA测序和全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）数据。
2）方法：
对粪便样本进行宏基因组测序以分析微生物组成。
通过16S rRNA测序分析肿瘤和AN组织的微生物组成。
使用WGBS技术评估DNA甲基化水平。
3）研究概述：
粪便样本的宏基因组测序，进行粪便微生物组的元分析（S1A-S1B）；
基于肿瘤和匹配的肿瘤邻近（AN）组织的16S rRNA测序和WGBS测序，比较了粪便和组织微生物组在不同水平上的差异（S1C-S1E）。
TCGA CRC队列中甲基化-微生物关联分析识别研究队列和TCGA CRC队列中甲基化与微生物组的关联（S1F和G）。
图S1：多维度探究CRC与微生物组之间的相互作用及其对DNA甲基化的影响三、结果
（一）CRC中肠道微生物组的变化及其对宿主细胞DNA甲基化的影响
研究人员通过粪便样本的宏基因组测序数据比较18名结直肠癌（CRC）患者和18名健康对照（HC）之间的肠道微生物组。
评估了CRC和HC之间α多样性指数，包括群落丰富度、多样性和均匀度，但并未发现CRC和HC之间存在显著差异（图S2）。
为了评估β多样性，进行了偏最小二乘判别分析（PLS-DA），结果显示CRC患者的粪便微生物群落与健康对照存在差异（图1A）。
通过比较HC和CRC患者之间的相对菌落丰度，研究人员发现几种先前与CRC相关的菌落在CRC粪便样本中富集，例如Fusobacterium nucleatum和Bacteroides thetaiotaomicron（图1B）。
微生物功能途径分析发现CRC患者的粪便微生物组与健康对照存在显著差异，特别是在与蛋氨酸代谢相关的途径上；（图1C）。
图1
图S2（二）肿瘤组织微生物组中蛋氨酸代谢的改变
为进一步探索肿瘤和邻近正常组织微生物组之间的差异，并研究微生物组如何影响蛋氨酸代谢，24对肿瘤和邻近正常（AN）组织样本的微生物组16S rRNA基因扩增子测序数据。
他们发现肿瘤和AN组织之间的微生物结构和组成存在差异（图2A-C），α多样性在肿瘤和AN组织之间保持了可比性（图S3），但在β多样性以及多个分类水平上的微生物丰度存在显著差异。
通过PICRUSt2预测微生物组的MetaCyc途径和酶功能，研究人员发现与蛋氨酸代谢相关的功能和途径显著富集。
为了加强发现，研究人员将数据与另外四个CRC和匹配AN组织的16S rRNA测序数据集结合起来进行元分析，发现L-蛋氨酸生物合成III途径在肿瘤样本中富集，而甲硫氨酸合酶在邻近正常样本中富集，以上结果进一步证实了肿瘤和邻近正常组织间在蛋氨酸代谢途径上的差异；（图2F, G）。
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图S3（三）粪便和组织微生物组在CRC中的关联
研究人员探讨了粪便微生物组与组织微生物组之间的关联。
基于粪便和组织样本的微生物组数据，进行肿瘤和AN组织α和β多样性比较和相关性分析。
他们发现粪便微生物组的丰富度与组织微生物组没有明显的关联，但Shannon指数在组织样本中显著更高（图3B）。β多样性分析显示粪便样本的微生物组与组织样本不同（图3C），且粪便微生物组与肿瘤微生物组的距离略高于与AN微生物组的距离（图3D）。
识别了粪便微生物组与肿瘤或AN组织微生物组之间的正相关微生物途径；鉴定了肿瘤特异性相关途径的例子（图3E-3F）；
研究结果表明粪便微生物组分析只能部分代表结肠组织微生物组，且粪便微生物组的功能属性可能部分反映肿瘤组织的特性。
图3（四）CRC肿瘤和邻近正常组织中的不同DNA甲基化特征
研究人员使用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）对13对CRC组织和相应的邻近正常结肠组织进行了DNA甲基化分析。
CRC组织和匹配AN组织之间整体甲基化水平的比较，基于WGBS测序数据，进行差异甲基化位点（DML）和区域（DMR）的鉴定、PCA分析评估CRC肿瘤和AN组织之间的全基因组DNA甲基化差异。
CRC组织和匹配AN组织之间整体甲基化水平的比较，发现CRC组织的整体甲基化水平显著低于匹配的AN组织（图4A）。
主成分分析（PCA）显示肿瘤和AN组织之间的甲基化特征存在明显差异（图4B）。
通过额外分析TCGA-CRC队列中的45对肿瘤和AN组织，进一步验证了这些发现（图4D）
进一步识别CRC组织和匹配AN组织之间显著低甲基化和高甲基化区域在基因组区域的分布，识别启动子区域内差异甲基化位点（图4E-4F）
对差异甲基化基因进行了功能富集分析，发现这些基因在G蛋白偶联受体信号传导途径和离子转运等功能中富集（图4G）
图4（五）肿瘤组织中微生物与启动子甲基化的关联受到干扰
为进一步研究微生物与CRC组织中DNA甲基化之间的相互作用
研究人员基于微生物群落丰度和宿主DNA甲基化水平的数据，通过相关性分析、lasso回归模型、稳定性选择等方法，进行微生物群落丰度与宿主DNA甲基化水平的关联分析。
他们发现在肿瘤和AN组织之间，与全局CpG甲基化水平相关的微生物属和种的丰度存在显著差异，展示属和种水平上微生物丰度与AN和肿瘤组织中总DNA甲基化水平的相关性（图5A）。
通过lasso回归模型，鉴定了与整个基因组中CpG位点甲基化水平相关的特定微生物群落，展示微生物相关的甲基化位点在不同基因组区域的富集（图5B）。
结果表明微生物组成及其对DNA甲基化的影响在肿瘤组织和AN组织之间可能存在显著差异。
（六）微生物调控启动子区域的甲基化水平
进一步揭示特定微生物群落如何调控启动子区域的DNA甲基化水平，相关性分析识别微生物群落与启动子CpG位点甲基化水平的关联，展示AN和肿瘤组织中特定微生物丰度与启动子CpG位点的关联（图5C和D）
结果发现在AN和肿瘤组织中分别有27和41个微生物群落与CpG位点的甲基化水平相关。在AN组织中，健康有益的微生物与基因甲基化之间的多种关联被发现，而在肿瘤组织中，潜在的机会致病菌与基因甲基化之间的关联更为常见。
图5（七）肿瘤微生物反复与宿主基因甲基化相关
研究人员进一步对特定微生物群落如何通过甲基化调控宿主基因表达进行了深入分析。
基于TCGA-CRC队列和研究人员自己的临床样本数据，相关性分析分别识别与AN组织、肿瘤组织中宿主启动子CpG甲基化水平一致关联的属（图6A-6B）；
结果发现在肿瘤组织中与宿主启动子CpG甲基化水平一致关联的五个属，包括Fusobacterium、Stenotrophomonas、Bacteroides、Ralstonia和Clostridium。
微生物相关基因在AN和肿瘤组织中的功能富集分析，发现某些微生物可能在维持正常细胞功能或驱动肿瘤发展中通过调控DNA甲基化模式发挥重要作用（图6C和D）。
图6（八）微生物途径与宿主基因启动子甲基化的关联
微生物和宿主DNA甲基化模式的关联，进一步探索对这些微生物如何通过影响甲基供体代谢来调控宿主细胞的DNA甲基化。
微生物群落丰度和宿主基因组中启动子区域的甲基化水平的数据，分别基于AN组织、肿瘤组织，相关性分析探索微生物途径与宿主基因启动子甲基化状态之间的复杂联系，识别与宿主基因甲基化水平相关的微生物途径（图7A-7B）。
他们发现在AN组织中，与宿主基因甲基化模式相关的“UDP-N-乙酰葡萄糖胺衍生的O-抗原构建块生物合成超途径”与多个基因的启动子甲基化模式相关联。
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