本文原载于《
中华眼科杂志》2017年第3期
LGR4 （leucine-rich repeat domain-containing G protein-coupled receptor 4）是G蛋白偶联受体家族成员之一，在包括眼在内的多种器官发育中发挥重要作用，与多种人类疾病的发生密切相关。本文将对LGR4介导的信号通路及其在眼发育过程中的功能和分子机制进行总结。
一、LGR4介导的信号通路
G蛋白偶联受体是哺乳动物体内最大的跨膜蛋白家族，参与机体众多的生理过程
[1]
。该类受体均具有相似结构，为7个跨膜蛋白多肽链
[2]
，可将细胞外信号传入细胞内，发挥生物学作用。G蛋白偶联受体的配体种类多样，包括激素、神经传导物质、趋化因子、离子等
[3]
。许多药物是以G蛋白偶联受体作为直接或间接靶向标志而发挥作用
[1]
。
LGRs （leucine-rich repeat domain-containing G protein-coupled receptors）是G蛋白偶联受体家族中高度保守的一类蛋白，其特征为胞外N末端富含9~18个亮氨酸重复序列
[4]
。该类受体可以分为3个大类。第1类为经典的糖蛋白激素受体，包括促黄体生成激素受体、促卵泡激素受体和促甲状腺激素受体。第2类受体包括LGR4-6，具有高度同源性，在很长一段时间内均未发现其胞外配体，因此其被称为孤儿受体。近几年，数种配体被发现可以活化LGR4-6，激活下游的Wnt信号通路和经典的G蛋白偶联受体通路。第3类受体即耻骨松弛激素受体LGR7和LGR8
[5]
。
LGR4是具有17个富含亮氨酸重复序列和7个跨膜结构的大分子蛋白，与不同的配体结合后，可以激活不同的下游信号通路。目前研究发现LGR4介导的信号通路主要有3条（图1）：（1) Wnt/β-catenin信号通路：与R-spondin或Norrin结合后，激活Wnt信号通路。分泌型蛋白R-spondins被证明是LGR4的内源性配体之一
[6,7]
。LGR4与R-spondin结合，抑制肿瘤抑制因子ZNRF3和环指蛋白43表达，增强Wnt与受体Frizzled和辅助受体脂蛋白受体相关蛋白5/6结合，活化下游Dishevelled，使糖原合成酶激酶3磷酸化，导致糖原合成酶激酶3/Axin/腺瘤性结肠息肉病相关蛋白/β-catenin复合物解离，β-catenin在胞内积聚，入核后激活下游转录因子发挥生物学作用
[8]
。Glinka等
[9]
提出在体外LGR4可作为R-spondin受体调控Wnt/β-catenin和Wnt介导的平面细胞极化信号通路。 （2）与肿瘤坏死因子相关激活诱导细胞因子11 （tumor necrosis factor related activation-induced cytokine，RNAKL）结合后，激活G蛋白偶联受体通路。LGR4可以通过与RNAKL结合，活化Gαq和糖原合成酶3-β来抑制活化T细胞核因子1蛋白（nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 ，NFATc1）的核转录。另一方面LGR4可以与RNAKL唯一受体（RANK）竞争结合RNAKL，从而抑制RANK下游的信号通路而抑制NFATc1的核转录。 （3）激活上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路。Wang等
[10]
在研究小鼠眼睑发育过程时发现，LGR4可以通过活化人肝素结合性表皮生长因子（human heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）激活EGFR信号通路，在眼睑上皮细胞的迁移和增殖中发挥作用。此外，LGR4还可以通过经典的环磷酸腺苷信号通路调控盐皮质激素
[11]
、雄性生殖系统中的雌激素受体α
[12]
、骨形成及血细胞发育中的转录激活因子4 （activating transcription factor 4，ATF4 ）
[13,14]
以及眼发育中的Pitx2 （Paired-like homeodomain transcription factor 2）因子
[5]
等，但目前还未找到LGR4激活这些通路的胞外配体。通过调控这些信号通路，LGR4在小鼠和人类的发育以及正常生理过程中发挥着非常重要的作用。
二、LGR4在发育中的作用
小鼠与人类的LGR4表达存在明显差异。在成年小鼠中，LGR4主要在肝脏表达，其次是肾脏，在肌肉、心脏和大脑中呈现中等水平表达，在睾丸和肺内表达量较低
[15]
。在初生小鼠中，LGR4在肾脏、肾上腺、胃、脊柱、肋骨、大脑、鼻腔、心脏及肠道中呈现中等水平表达，在肝脏、肺及脾脏中呈现低水平表达，在骨骼肌和胰腺中无表达。在成年人类中，LGR4在胰腺中的表达量最高，在肝脏、心脏及肌肉中呈现中等水平表达，在大脑和肾脏中表达量较低
[15]
。
LGR4
-/-
小鼠60％在胚胎发育期死亡，出生后40％死于围产期
[16]
。LGR4
-/-
小鼠胚胎发育迟缓，体重低主要因肝脏和肾脏的重量不足，同时伴有一系列生长发育异常，包括：（1）红细胞生成障碍，表现为妊娠中期小鼠个体小于野生型小鼠，肉眼观察胚胎颜色比野生型苍白且无血色，血细胞生成异常
[14]
；（2）骨发育异常，胚胎成骨细胞分化障碍，破骨细胞功能增强
[17]
，影响胚胎骨的发育，导致成年后骨密度降低
[13]
；（3）胆囊和胆囊管缺如，胆道癌的发生率增加
[18]
，但不影响正常的肝胆管和肝内胆管发育
[19]
；（4）体内电解质平衡紊乱，LGR4可以调节盐皮质激素受体的表达，这使得LGR4在调节体内电解质平衡中发挥一定作用
[11]
；（5）生殖系统损伤，LGR4
-/-
雌雄小鼠均表现出生殖系统损伤，这与LGR4
-/-
小鼠低出生率相关
[12,20,21,22,23]
；（6）肠道发育异常，炎性反应性肠病的发生率增加
[24]
，胃癌的淋巴转移
[25]
也被证明与LGR4的表达异常有关；（7）毛囊发育异常
[26]
，乳腺导管的分化和延长出现异常
[27]
等。
三、LGR4在小鼠眼发育及相关疾病中的作用
在眼发育过程中，LGR4的表达呈现出精细的时空调节模式。在小鼠胚胎第12.5天，LGR4主要在视杯与表面外胚层之间的一层间叶细胞中表达。到了小鼠胚胎第16.5天，可以在视杯的尖端和间质中检测到高浓度的LGR4表达，这部分组织随后将发育成虹膜和睫状体，但在角膜、视网膜、晶状体中含量较低。到出生后，小鼠的睫状体、虹膜基质、晶状体及角膜上皮细胞层持续高表达LGR4，在角膜基质细胞及上皮下细胞中LGR4表达量降低
[28]
。成年小鼠在晶状体上皮细胞、神经节、内核层、虹膜基质及外睫状体细胞层中表达LGR4
[5]
。
对基因敲除小鼠进行研究，发现小鼠敲除LGR4基因后会表现出不同程度的眼部发育异常，包括小眼畸形
[5]
、角膜炎性反应、角膜囊肿、角膜血管翳、角膜局部混浊并伴随角膜新生血管、白内障等，且在雄性小鼠中发病率较高
[5]
。LGR4可以通过环磷腺苷效应元件结合蛋白信号通路调节Pitx2的表达，而Pitx2在眼的发育中具有重要作用。Pitx2表达异常会出现Axenfeld-Rieger综合征和眼前节发育不良等眼部发育异常性疾病
[5]
。因此，LGR4在眼的发育过程中起着重要的作用。
（一）LGR4与眼睑发育及相关疾病
眼睑的发育是一个动态过程。小鼠眼睑发育开始于胚胎第11.5天，由角膜周围逐渐向眼中心延伸，在胚胎第15.5~16.5天，眼睑完全融合，融合的眼睑可以作为保护层，维持眼的正常发育，在出生后第12~14天眼睑睁开。多种细胞因子作用下的细胞增殖、分化和迁移等过程，在眼睑的发育中发挥重要作用。眼睑发育不良将导致出生眼睑闭合不全，即出生时上下眼睑无法完全闭合，部分眼球暴露，出现角膜炎性反应。相关研究发现敲除LGR4基因后小鼠在胚胎发育过程中眼睑无法融合，导致出生后眼睑闭合不全
[29]
，说明LGR4在眼睑发育中起着非常重要的作用。
在小鼠胚胎第14~16天，眼睑顶端基部上皮细胞和间质表达LGR4。LGR4
-/-
小鼠在胚胎第12.5天，眼睑形态与正常小鼠相似，但眼睑上皮细胞增殖速率降低；在胚胎第14.5天，可以观察到眼睑上皮细胞丝状伪足减少
[29]
；到了胚胎第15.5天，眼睑向角膜中心迁移的速率减慢
[30]
。在眼睑发育过程中，正常小鼠在胚胎第15.5天时可以明显检测到EGFR磷酸化，同时期的LGR4
-/-
小鼠眼睑内的EGFR磷酸化水平明显降低，但两者的总EGFR蛋白水平差异不大
[29]
。
后续的体外实验研究发现，敲除LGR4基因后角质细胞中EGFR的磷酸化水平下降了1.6~2.0倍，但EGFR总水平基本不变。LGR4
-/-
角质细胞HB-EGF分泌的量明显下降，并且EGFR、细胞外调节蛋白激酶及信号传导与转录激活因子3的磷酸化水平也明显下降，同时细胞的增殖和迁移能力下降。在LGR4
-/-
角质细胞培养基中增加HB-EGF的量，EGFR、细胞外调节蛋白激酶信号传导与转录激活因子3的磷酸化水平以及细胞的增殖和迁移能力恢复。由此说明，LGR4是通过调节HB-EGF的表达以激活EGFR信号通路，从而影响眼睑上皮细胞的增殖和迁移，在眼睑的发育中发挥作用
[10]
。
（二）LGR4与角膜发育及相关疾病
在LGR4
-/-
小鼠中，角膜损伤非常常见。在LGR4
-/-
小鼠的眼发育早期阶段，角膜上皮细胞的增殖和分化明显减慢，出现角膜上皮发育不良，并伴有角膜炎性反应、角膜囊肿、角膜血管翳等
[5]
。在维持角膜正常生理功能方面起重要作用的角膜外基质蛋白，如胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅴ、双糖链蛋白聚糖、骨诱导因子重组蛋白、角蛋白、光蛋白聚糖等
[31]
，表达量明显下降，导致角膜透明度降低，角膜细胞生理功能和角膜结构异常
[32]
。
敲除LGR4基因后，对眼前节发育至关重要的一个转录因子Pitx2的表达量明显下降，导致两个维持胶原蛋白稳定的主要酶Plod1和Plod2的表达量下降，从而影响角膜的正常发育
[5]
。此外，敲除LGR4基因后，眼睑发育异常以致无法闭合，不能在眼表起到保护层的作用，从而无法很好地维持角膜的正常发育。
（三）LGR4与虹膜发育及相关疾病
青光眼是一种以不可逆性视神经损伤、视野缺损为特征的致盲性眼病，最常见的病因是各种原因导致的房水循环障碍，使眼压升高
[33]
，如前房角狭窄甚至关闭、小梁硬化等。LGR4
-/-
小鼠会出现虹膜发育不良，在虹膜发育早期，平滑肌激动蛋白表达量明显减少，导致虹膜平滑肌发育障碍，虹膜收缩功能异常，睫状体变小，弹性减弱，致使小梁网被压缩，梁样结构减少，部分虹膜角膜角较窄的小鼠会出现前房角完全关闭的状态。42%LGR4
-/-
小鼠在出生6个月时可以检测到视网膜内核层神经节细胞减少和外核层损伤，这说明敲除LGR4基因导致的虹膜发育不良与早期发病的青光眼有关
[5]
。
