探索｜心血管疾病基因疗法的研究进展

Clinic門诊新视野 · 公众号 · 医学 · 2024-11-23 19:38

正文

心血管疾病（CVD）仍然是全球发病率和死亡率的主要病因，近期研究发现阐明了遗传学在心血管疾病发病机制中的重要作用，包括单基因和多基因机制，并确定了基因疗法的具体靶点，当前已开发了创新基因疗法来纠正导致单基因疾病的致病性变异（PVs），如肥厚型、扩张型或致心律失常性心肌病和高胆固醇血症。这些基因疗法策略包括递送外源基因以补充由PVs引起的蛋白质水平不足，或进行基因组编辑以纠正、删除或修改突变序列以恢复蛋白质功能，不过将基因编辑器有效递送至特定细胞仍面临着诸多挑战，包括治疗持久性、组织特异性靶向、载体相关不良事件和脱靶效应等。本项美国心脏协会（AHA）科学咨询回顾了基因治疗的核心概念、关键障碍、患者风险和正在进行的研究努力，以使临床医生了解这种新兴疗法用于CVD的巨大前景及挑战。

基因疗法的机制

基因疗法根据因果遗传变异的机制和功能后果而有所不同（图1）。致病性变异（PVs）使1个等位基因失活，导致正常功能蛋白质产生不足及单倍剂量不足（haploinsufficiency）。基因疗法旨在通过递送外源蛋白质编码序列、增强内源性DNA序列表达、校正或修饰突变的DNA序列，产生正常或接近正常的蛋白质以增加蛋白质水平。具体而言，PVs通过产生足够数量具有有害功能的蛋白质而对机体造成显性负性作用（dominant negative effect），而基因疗法旨在使用小干扰RNA或反义寡核苷酸纠正PVs、灭活突变DNA等位基因或沉默异常转录物。基因疗法修饰DNA序列具有永久性效果，而基于RNA策略和外源蛋白质编码序列递送的持久性是可变的。基因疗法需修饰足够比例的靶细胞以对组织产生有益影响，并降低因未治疗细胞分裂造成疾病再发可能性。

图1. 基因疗法的机制

用于修饰DNA序列的工具正在快速发展。目前的基因编辑工具主要包括CRISPR-Cas9核酸酶系统、碱基编辑器和引物编辑器（图2）。尽管这些基因编辑工具的组件不同，但每种工具都包括靶向待修饰的特定序列的向导分子（RNA），以及切割DNA并替换、插入或多核苷酸删除的分子。含有CRISPR-Cas9核酸酶系统的基因组编辑工具产生DNA的双链断裂，通过非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）进行修复，在此期间随机DNA序列可能被删除或插入，并因引入终止密码子而过早终止基因转录。因此，通过适当的靶特异性，CRISPR-Cas9核酸酶系统可以灭活异常基因拷贝，不过由于多因素影响靶特异性，两个拷贝基因的失活可能会产生严重后果。碱基编辑器是一种替代的基因编辑工具，它将一种核苷酸转化为另一种核苷酸，特别是将胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，或腺嘌呤转化为鸟嘌呤。引物编辑器包括含有Cas9切口酶和修饰逆转录酶的融合蛋白，可以引入、删除或替代多个核苷酸，从而提供更广泛的治疗选择。碱基编辑器和引物编辑器不会引入断裂双链，因此比CRISPR-Cas9核酸酶系统更具可预测性和精确性。总而言之，这些基因编辑器通过引入终止密码子以降解携带显性负性突变（dominant negative variant）的异常拷贝，精确恢复正常DNA序列，或潜在引入激活序列以增加基因表达。

图2. 基因编辑工具

基因疗法的递送策略

基因编辑器的有效体内递送仍然是当前一大挑战，目前主要使用病毒载体和非病毒载体系统进行体内递送（图3）。病毒载体由缺陷型和非致病性病毒包膜组成，可防止全身递送过程中免疫介导的降解。腺相关病毒（AAV）是一种常用的病毒载体，其具有众多血清型和组织特异性嗜性，可优先递送到特定组织中，并持续存在于具有未分裂心肌细胞的器官中，或长时间缓慢分裂肝细胞而无副作用。非病毒递送系统以脂质纳米颗粒（LNPs）为代表，LNP通常由可电离的脂质、两亲性磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质组成，这些脂质颗粒包裹编码基因组编辑器或补充基因的核酸，并促进它们递送到细胞中，具有易于制作和降低免疫反应的优点，不过LNP及相关载体具有较低的组织特异性，并且由于固有的肝脏向性而主要在肝脏中积累，从而限制了向心肌细胞的有效递送。

图3. 基因疗法的递送策略

CVD基因疗法最新进展

CVD基因治疗的开发和临床应用在一些领域取得显著进展，例如小干扰RNA治疗高脂血症及降低心脏淀粉样变性中损伤蛋白水平。动物模型和人类CVD患者研究还考察了通过CRISPR-Cas9核酸酶系统永久失活突变基因等位基因，同时保留具有正常DNA序列的另一等位基因的替代治疗方法，此外由单倍剂量不足引起的CVD基因治疗亦在积极研究之中。例如，美国FDA最近批准了编码微肌营养不良蛋白序列的AAV递送系统，以解决肌营养不良蛋白单倍剂量不足，当前评估微肌营养不良蛋白安全性和有效性的随机、双盲、安慰剂对照3期临床试验结果尚未完全公布。与此同时，通过基因组编辑纠正潜在PVs治疗方法的临床前和临床研究正在进行中，例如在肥厚型心肌病和扩张型心肌病的动物模型中，通过AAV9递送碱基编辑器具有永久纠正PVs的潜力，不过值得注意的是，这些临床前研究中CVD基因疗法预防了疾病发生，但迄今为止没有研究发现其逆转了已确诊的CVD疾病。

在患有杂合家族性高胆固醇血症或未控制高胆固醇血症的灵长类动物和人类患者中，使PCSK9基因失活的碱基编辑器LNP递送系统已被发现可显著且持久性地降低LDL-C水平。此外，当前已有20多项早期临床试验正在进行中，旨在考察通过病毒和非病毒递送系统进行基因替换或基因组编辑治疗各种类型CVD的安全性和有效性（图4）。

图4. CVD基因疗法最新进展

CVD基因疗法的挑战和限制

心血管疾病的基因疗法为CVD患者提供了疾病预防、永久性治愈和避免终生服药的机会，有助于减轻患者、医疗系统和社会总体疾病负担，但当前仍面临以下几大技术挑战：其一、基因疗法对组织、细胞类型和DNA序列的靶特异性仍存在不足；其二、基因疗法的载体和非人序列可能引发免疫反应，25%个体中存在预先存在的中和AAV抗体，限制了初始治疗的有效性并阻止了重复给药；其三、CVD基因疗法中，如何最大限度地减少急性不良反应并提高治疗效果是值得关注的问题，临床试验中超过30%使用AAV载体的患者报告了严重不良事件，包括肝毒性、血栓性微血管病（全身递送）、神经毒性（中枢神经系统递送）、急性呼吸窘迫综合征和死亡。

本文内容为《门诊》杂志原创内容

转载须经授权并请注明出处。

Clinic門诊新视野｜微信号：ClinicMZ

《门诊》杂志官方微信

长按，识别二维码，加关注