Plus深读 | TLR8小分子抑制剂能够抑制其炎症激活功能

背景

病原体导致机体产生免疫反应的过程：

病原体信号刺激pattern recognition receptors (PRRs)，识别后促进细胞内炎症反应发生；这其中最深入研究的一类PRR就是TLRs（Toll-like receptors）。

TLR家族蛋白共计10个，分别在质膜或者核膜上起功能；其中定位在核膜上的包括：

• TLR3：识别病毒和dsRNA

• TLR7/8：识别ssRNA

• TLR9：识别未正确甲基化的CpG

文章主要内容

1. 在过表达TLR8的稳定细胞系中Screening，找到小分子抑制剂抑制剂，能够结合并抑制TLR8蛋白功能。

2. 细胞水平、疾病水平验证TLR8抑制剂的炎症抑制功能。

3. 机理：结晶发现，抑制剂结合的是TLR8蛋白上的蛋白间相互作用结构，从而稳定同源二聚体结构，使得二聚体不能解开、TLR8无法变构成为活性形式。

亮点

传统的生物学方法，筛选新药一般包括三个层面：

寻找靶点特异性药物—揭示分子机理—探索细胞和动物水平生物学功能；

本研究在完成上述的前提下，还利用结构生物学方法，获得晶体、并确定了药物调节TLR8的结构和分子机理。

1：筛选化合物库，获得TLR8抑制剂

构建工程细胞株： TLR8过表达的稳定细胞系

鉴定方法： secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) assay，分析TLR8功能强弱

正对照： NF-κB抑制剂

化合物库： Maybridge HitFinder V11

筛选结果： 寻找到72个化合物，能够抑制TLR8信号通路活性超过85%以上；

这其中4个化合物：SB1723，SEW04865，BTB08278和BTB08295，是TLR8特异性的。分析发现SB1723和SEW04865都有7-phenylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine分子骨架，因此通过合成得到了包含该骨架、且结构更简单的化合物CU-CPT8m仅微毒性，且同样具有专一性抑制TLR8功能的作用：表现为1）SEAP assay；2）抑制TNF-α分泌；3）抑制IL-8分泌（Fig.1）。

Figure 1

2：获得TLR8-CU-CPT8m复合体结晶，并分析序列和活性位点

通过分析TLR8-CU-CPT8m复合体结晶的X射线衍射结果，研究者发现CU-CPT8m结合的是两个TLR8形成的同源二聚体，位于两个TLR8蛋白结合的位置。具体来说CU-CPT8m的结合同时需要两个TLR8的多个氨基酸残基，且涵盖多种相互作用方式，如Figure 2：

1）范德华力：TLR8-1上的F261、F346、V378、I403、F405，TLR8-2上的F494、A518、V520、Y567；

2）π–π堆叠：TLR8-1上的Y348，TLR8-2上的F495；

3）氢键：TLR8-1上的G351，TLR8-2上的V520。

按照结构域来分析：

一个TLR8二聚体上面需要结合两个分子的CU-CPT8m；这其中每个CU-CPT8m都结合TLR8-1上的LRR11-13和TLR8-2上的LRR17-18时，是激活型结合-agonist（Fig.3）；每个CU-CPT8m都结合TLR8-1上的LRR11-13和TLR8-2上的LRR15-16时，是抑制型结合-antagonist（Fig.3）。

有趣的是，这些位点都是两个TLR8蛋白形成同源二聚体时的相互结合片段。

Figure 2

Figure 3

3：CU-CPT8m结合和抑制TLR8功能的原理

研究者进一步合成了CU-CPT8m两个结构类似物：CU-CPT8a/b（Fig.4a），并证明其具有CU-CPT8m相似的TLR8抑制功能。

其中CU-CPT8b的羟基（-OH）产生了更强的极性，结晶分析发现，除了CU-CPT8m的结合位点外，产生了更多的作用位点：TLR8-2上的S516和Q519（Fig.4b-c）。

Figure 4c证明CU-CPT8m/b对TLR8的抑制作用机理，是由于它们的结合会使得TLR8的二聚体结合紧密，无法解开、激活。

Figure 4