【生信文献200篇】01 探究为何一个TNBC对gefitinib过于敏感

三阴性乳腺癌在多个水平上存在异质性，且目前尚未有针对化疗耐药患者的靶向治疗药物，并且针对EGFR的疗法虽然能提高临床受益率但在乳腺癌亚群中具有不可预测性。作者通过构建PDXs模型，筛选到一个特殊应答的PDX(GCRC1735)，该例样本对药物治疗效果非常敏感。对GCRC1735的3500个细胞进行单细胞转录组测序分析，鉴定出6个细胞亚群，其中EGFR高表达的细胞在间充质/细胞样细胞亚群中显著富集。分选EGFR ^hi 和EGFR ^lo 细胞亚群，且EGFR ^hi 亚群表现出增强的干细胞样特征，包括ALDH活性、球状形成效率、致瘤性和转移性。表明EGFR依赖性的细胞扩增和分级状态转变。在独立的PDX中鉴定了类似的致瘤性EGFR亚群，其中EGFR表达与吉非替尼敏感性相关，为TNBC患者中EGFR依赖性分级以及治疗干预提供了新的理解。

三阴性乳腺癌(TNBC)： ER、PR、HER2均为阴性的乳腺癌，其在多个水平上存在异质性； 大约30%的TNBC对标准化学治疗药物敏感，可提高生存率，但目前 尚未有获批的针对化疗耐药患者的靶向治疗药物；

表皮生长因子受体(EGFR)在部分TNBC高表达，但EGFR靶向疗法的临床受益率只有1.7%-38.7%，表明针对EGFR的疗法在乳腺癌亚群中具有可变且不可预测的反应；

肿瘤起始细胞(TICs) 是一种类似干细胞的亚群，负责维持肿瘤的长期克隆，在治疗耐药中被广泛研究。

1. 实验方法：

• 构建PDXs模型；

• 体内药物试验 In vivo drug testing；

• 流式细胞术；

• Sphere-formation assay；

• 荧光杂交(FISH)；

• qPCR；

• 免疫印迹Immunoblotting；

• 免疫组化 Immunohistochemistry (IHC)；

• 免疫荧光 Immunofluorescence (IF)

2. 数据分析

• Bulk transcriptional profiling；

• 对公开的基因表达数据进行分析；

• 外显子组测序及分析；

• 单细胞转录组测序及分析。

3.相关数据：

• SRP100090(PRJNA374893)

• SRP110989(PRJNA392838)：single cell RNA-seq

5个公共数据：

• BRCA1 and familial breast cancers (GSE49481)(Larsen et al., 2014)

• pre/post-chemotherapy (GSE32072)(Gonzalez-Angulo et al., 2012)

• FACS normal mammary cell (GSE16997)(Lim et al., 2009)

• (GSE37223)(Kannan et al., 2013)

• FACS normal mammary cells single-cell qPCR (GSE70554)(Lawson et al., 2015).

主要是看差异表达，还有用GOBO算法看signature scores。

Breast Cancer PDXs Display Variable Response to EGFR Inhibition, Identifying an Exceptional Responder

作者构建了一个主要由TNBC组成的PDXs模型(15/18)，筛选对EGFR抑制剂 gefitinib （吉非替尼）敏感性的队列。结果18个模型中有6个发生了至少50%的肿瘤生长抑制，其中一个敏感性最高(GCRC1735)(图A)。该PDX模型在治疗7个月后肿瘤明显消退，肿瘤无反弹生长(图B)。通过扩大验证，发现结果一致(图C-D)。

PDX模型经过吉非替尼治疗2天后显示了靶向抑制，其特征是pEGFR降低(图E)，pERK下调(图E)，激活了凋亡通路(图F)。第7天表现出增殖抑制(图1G)。

对 GCRC1735 的原发肿瘤进行了组织学、转录组和基因组分析，发现患者携带BRCA1突变(p.C1225Sfs)和体细胞TP53改变(p.R249T)。但EGFR中未发现单核苷酸变异(SNVs)或拷贝数改变(CNAs)。因此，EGFR及其信号通路成员的基因改变不能解释对EGFR抑制的异常反应。

Single-Cell RNA Sequencing Identifies EGFR within a Mesenchymal/Stem-like Subpopulation

通过免疫荧光法(IF)，在原发肿瘤和PDX恶性细胞中均观察到EGFR异质表达(图2A)。

为准确了解与异质EGFR表达相关的功能特性，作者在PDX新鲜分离的细胞上进行了单细胞RNA-seq(3,483个细胞，平均每个细胞检测到40,564个独特的分子标识(UMIs)和5,146个基因)。使用来自前5个主要成分的基因进行无监督的基于图的细胞聚类，并使用t-SNE进行可视化。

分为了six subpopulations 六个亚群：

• a mesenchymal/stem(M/S) cluster，表现为 EGFR 和 mesenchymal 相关基因高表达；

• the nuclear/mitochondrial cluster，表现为 nuclear 和 mitochondrial 基因定位高表达；

• a proliferative cluster，表现为细胞周期相关基因高表达；

• the antigen presentation cluster，表现为抗原呈递相关基因高表达；

• the basal cluster，包括 基底细胞表达标记物(KRT6A/B, KRT17, KRT14, and KRT5) 等markers；

• A transitional cluster，差异基因太少，去除。

EGFR高表达细胞亚群其转录特征与不良预后TNBC相关。

An EGFR hi Mesenchymal/Stem Subpopulation Is Functionally Enriched for Tumor Potential

通过拟时序分析(Monocle)发现，间充质/干细胞亚群分布于末端分支(图3A)。间充质/干细胞亚群与正常乳腺干细胞特征之间存在显著重叠，并且在正常乳房的基质细胞中间充质/干细胞 Marker 基因和 EGFR 高表达(图3B)，表现了间充质/干细胞亚群的未分化性质，及增强再生能力。

使用荧光激活细胞(FACS)分选EGFR ^hi 和EGFR ^lo 细胞亚群；EGFR表达增强，并且来自间充质/干细胞特征的基因显示其与单细胞测序的特征相同(图3C-D)。

为了证明EGFR细胞是具有更高的成瘤能力，作者分别开展了体内和体外验证试验。与EGFR ^lo 亚群相比，在EGFR ^hi 中ALDH活性增强、球形成效率(SFE)提高(图E-F)，两者都与肿瘤起始能力相关。

通过surrogate实验发现EGER ^hi 成瘤能力更强(图3G)，且 EGER ^hi 细胞形成的原发瘤中，重现了EGFR ^hi 和EGFR ^lo 细胞的异质表达模式(图3H)。未分选的细胞在移植成瘤后出现了EGFR ^hi 和EGFR ^lo 细胞重构(图3I)。