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在PCR实验中，有那些因素影响了「PCR反应」？“全家桶”大礼包来袭！

NIRO科研喵 · 公众号 · · 2024-09-23 07:30

正文

作者 | NIRO

来源 | NIRO（ID：NIRO-keyanmiao）

编辑 | 澹泊研究僧

在PCR实验中，有多种因素共同影响了PCR反应的效率、特异性和产物质量。对于PCR实验，我们已经熟悉得不能再熟悉了，但是要想真正了解PCR实验的有趣之处，还是要对其组分分析并了解，这些组分在PCR实验中分别起了什么作用？对PCR实验有什么影响？ 如果这些都了解了，相信你已经是一名合格的科研打工吗喽了 ！

PCR反应中的抑制因素主要来源于样本处理、试剂质量、反应条件以及外部污染等多个方面。以下主要分为3个部分进行讲述:

PCR反应抑制因素
标本中PCR抑制物来源及作用机制
PCR增强剂

PCR反应抑制因素

随着PCR反应中，其成分主要依旧为引物、DNA聚合酶、dNTPs以及Mg ²⁺ 等，作为整个体系的内部核心因素，同时为了让PCR试剂适用于不同的应用场景，也加入了不少其他成分对PCR试剂起到不同的作用。

1. 体系内部因素

(1) 引物: PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸序列，能够特异性地识别并结合模板DNA的特定区域，从而引导DNA聚合酶进行链的延伸和扩增。因此，在PCR反应中，首要任务就是引物设计。感兴趣的同学可以浏览这2篇文章《干货 | NCBI/Oligo 7/primer 5 三种方法进行PCR引物设计教程》、《从此再也不用自己设计qPCR引物了，包括66种植物3331426个基因引物，还有115种植物qPCR内参基因数据库》。

引物设计必须遵循的原则:

① 引物长度要合适。一般引物的长度为15-30个碱基，引物过短会降低扩增的特异性，而过长则会使退火温度提高，不利于引物模板结合，容易形成二聚体。长不利于引物与模板结合且引物易形成二级结构，过短则特异性差。

② 引物GC含量要适宜。引物的GC含量(鸟嘌呤和胞嘧啶含量)一般为40-60%之间，上下游引物的GC含量不能相差太大，尽量保持一致，避免GC含量过高或过低都不利于PCR反应的进行。GC含量过高可能导致非特异性扩增，而GC含量过低则可能使引物稳定性降低。 一般建议避免在引物3'端使用A/T ，由于A和T之间只有两个氢键，相对于G和C之间的三个氢键来说稳定性较差。如果3'端以A/T结尾，可能会增加错误引发的风险，即DNA聚合酶可能在非特异性位点开始合成新链。同时应尽量 避免在 3'端出现连续G/C序列 ，连续的G/C序列(尤其是3个或3个以上)可能会形成稳定的二级结构(如发夹结构)，这些结构会干扰引物与模板DNA的结合，从而降低PCR的特异性和效率。

③ 引物自身及引物之间不应存在互补序列，这个设计原则很重要。碱基要随机分布，引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构，这种结构会改变引物的三维形状，使其难与模板DNA正确结合，从而降低PCR的扩增效率，还可能干扰DNA聚合酶的活性，阻碍DNA聚合酶在引物 3'端的结合和延伸。

此外，还会产生二聚体结构，这是由于两个引物分子之间的互补序列相互配对而形成的双链结构，在PCR反应体系中，如果引物浓度较高且存在互补序列，那么引物之间有可能形成二聚体。在二聚体的形成会消耗大量的引物分子，从而降低有效引物的浓度，从而影响引物与模板的结合效率。

④ 引物5'端可以修饰，3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。引物5'端不决定扩增的特异性可以被修饰，引物5'端修饰包括：加酶切位点，标记荧光素/生物素，引入点突变、插入突变、缺失突变序列，引入启动子序列等。

⑤ Tm值在合适范围。Tm值是引物的一个重要参数，它反映了引物与模板DNA结合的稳定性。Tm值一般通过公式: Tm=4(G+C)+2(A+T)来估算， 理想的Tm值应接近PCR反应的退火温度，一般在55℃-80℃之间，最好接近72℃以使复性条件最佳。同时，上下游引物Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃ 。

⑥ 产物不能形成二级结构。因为二级结构会阻碍PCR扩增过程中的引物结合和DNA聚合酶的延伸，从而降低PCR的效率和特异性。要如何避免呢？使用NCBI-Blast在线预测或Primer5等，尽可能避免高GC含量、引物的互补性等。

⑦ 引物3'端不要终止于密码子(UAA、UAG、UGA)，因终止密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

(2) DNA聚合酶及其浓度: 酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。感兴趣的同学可以浏览这篇文章《如何识别多重qPCR酶的性能优异？》。

(3) dNTPs的质量和浓度: dNTP s 溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dNTP的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会影响PCR产物的产量。

(4) 核酸模板: 模板的量、纯度、完整度都对PCR反应有影响。感兴趣的同学可以浏览这几篇文章《每次都会问师兄师姐的问题，PCR实验加多少「模板DNA」呢？》、《不跑电泳就谈RNA质量好坏的，都是耍流氓！》、《让你RNA提取少走弯路！》、《实验十二 | RNA质量检测 (知识分享）》。

(5) Mg ²⁺ 浓度: 主要影响PCR扩增的特异性和产量，一般要对应dNTPs的浓度。当Mg ²⁺ 浓度过高时，反应的特异性会降低，导致非特异性扩增的出现。这是因为高浓度的Mg ²⁺ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板的非特异性结合，增加错误扩增的机会。相反，Mg ²⁺ 浓度过低则会降低DNA聚合酶的活性。DNA聚合酶需要Mg ²⁺ 作为辅因子来催化dNTPs的聚合反应，缺乏足够的Mg ²⁺ 会导致酶活性下降，从而使反应产物减少。

(6) Mg ²⁺ 浓度与dNTPs浓度的关系。 Mg ²⁺ 浓度通常需要与dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的浓度相匹配。一般来说，Mg ²⁺ 的浓度应比dNTPs的浓度稍高，以确保足够的酶活性和反应效率。具体的比例关系可能因实验条件和PCR体系的不同而有所差异，但通常建议Mg ²⁺ 浓度比dNTPs浓度高0.2~2.5 mM。

(7) 温度与时间的设置: PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火温度与时间、延伸温度与时间。

① 模板GC含量高要延长变性时间: 当模板DNA的GC含量较高时，GC碱基对之间的氢键比AT碱基对更强，因此需要更长的变性时间才能确保双链DNA完全分离成单链。延长变性时间有助于增加模板DNA在后续退火和延伸步骤中的可用性，从而提高PCR的效率和特异性。

② 引物碱基数较少，可以适当提高退火温度: 较短的引物与模板DNA的结合位点可能相对较少，因此提高退火温度可以减少引物与模板之间的非特异性结合，增加特异性扩增的机会。较高的退火温度有助于筛选出与模板DNA完全匹配的引物，从而提高PCR的特异性。

③ 引物碱基数较多，可以适当降低退火温度: 如果引物的碱基数较多，那么它们与模板DNA的结合位点也会相应增加。在这种情况下，适当降低退火温度可以使引物更容易与模板DNA结合，从而提高PCR的扩增效率。然而，需要注意的是，降低退火温度也可能增加非特异性扩增的风险，因此需要在保证扩增效率的同时，避免非特异性产物的产生。

④ 产物长度长需要对应延长延伸时间: PCR的延伸步骤是DNA聚合酶在引物的引导下，沿着模板DNA链合成新DNA链的过程。如果目标产物的长度较长，那么就需要更长的延伸时间来确保新DNA链的完整合成。因此，在设计PCR程序时，应根据目标产物的长度来设置合适的延伸时间，以确保PCR产物的完整性和产量。

(8) 循环次数: 循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。环循环次数越多，非特异性产物的量就越多，碱基错配率也越高。

2. 体系外部因素

在PCR过程中，多种物质可能作为抑制剂影响反应的进行，而这些抑制剂在PCR反应中的存在和浓度都可能影响反应的特异性和效率。因此，在进行PCR实验时，需要仔细控制反应条件，避免这些抑制剂的干扰。

(1) SDS(十二烷基硫酸钠)：

① 性质: 阴离子去污剂

② 作用机制: 破坏酶蛋白质的非共价键（氢键和疏水键），导致酶蛋白质变性，丧失其功能

③ 影响浓度: 0.01%即可完全抑制PCR反应，0.005%显著降低产量

(2) 苯酚：

① 性质: 有机溶剂

② 作用机制: 使酶蛋白变性

③ 影响浓度: 0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%显著降低产量

(3) 乙醇：

① 性质: 有机溶剂

② 作用: 大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些体系中可能增加产量

(4) 异丙醇：

① 性质: 有机溶剂

② 作用: 对PCR反应的抑制作用比乙醇稍强

(5) 乙酸钠(NaAc)：

① 性质: 无机盐

② 作用机制: 引起反应体系pH降低，与DNA形成钠盐复合物而聚合沉淀

③ 影响浓度: 大于5mM时抑制PCR反应

(6) 氯化钠：

① 性质: 无机盐

② 影响浓度: 大于25mM时抑制PCR反应，但生理盐水(0.9% NaCl)无影响

(7) EDTA：

① 性质: 金属离子螯合剂

② 作用机制: 螯合体系中的Mg2+，抑制聚合酶活性

③ 影响浓度: 0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物。感兴趣的可以浏览这篇文章《乙二胺四乙酸(EDTA)，在分子生物学中这样用，你知道吧？》。

(8) 血红素：

① 性质: 属于高等动物的红色素，血红蛋白的辅基，存在于高等动物的血液、肝脏与肌肉的色蛋白中。

② 影响浓度: 大于1mg/ml抑制PCR反应；有机溶剂法提取DNA的不好除去，易残留。

(9) 氯高铁血红素：

① 性质: 血红素的氧化形式( 血红素的中心离子二价铁离子在氧化剂存在并加热的情况下可被氧化成三价铁离子，变成褐色的高铁血红素)

② 影响浓度: 大于0.1ng/μl抑制PCR反应

(10) 丹宁酸( 鞣酸 )：

① 性质: 天然酚类有机化合物

，

为黄色或棕黄色粉末，其水溶液与铁盐溶液相遇变蓝黑色。

② 影响浓度: 大于0.1ng/μl抑制PCR反应

(11) 肝素：

① 性质: 聚阴离子糖胺聚糖类药物，由硫酸D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸组成的黏多糖，含多种硫酸根，呈强酸性。其中的阴离子与抗凝有关，因此肝素是一种聚阴离子糖胺聚糖类药物。它也存在于肺、血管壁、肠黏膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。

② 作用机制: 对MLV反转录酶和Taq DNA聚合酶均有很强的抑制作用，在核酸纯化的过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，且后续处理步骤不能去除肝素的这种干扰作用。

③ 影响浓度: 大于0.15 IU/ml抑制PCR反应

(12) 尿素：

① 性质: 有机化合物

② 影响浓度: 大于20mM时对PCR产生抑制

(13) 腐殖质：

① 来源: 土壤、植物材料、自然界水

② 作用机制: 可能通过对Mg2+的螯合作用抑制聚合酶活性

(14) 胆酸盐(胆汁酸盐)：

① 性质: 两性大分子

② 来源: 粪便

③ 作用机制: 能作为抑制剂影响PCR的效率和特异性

(15) 胆红素：

① 性质: 胆色素的一种，是人胆汁中的主要色素

② 作用机制: 抑制Taq酶活性

(16) 血红蛋白：

① 性质: 红细胞内的蛋白质

② 作用机制: 可能与Taq酶相互作用，抑制其活性，这种抑制抑制作用可能与释放铁离子有关

(17) 高血脂：

① 性质: 血液中脂质含量过高

② 作用机制: 高血脂会抑制Taq酶的活性，从而使扩增效率降低。高血脂对Real-Time PCR的干扰机制主要是血液中的低密度脂肪对荧光的屏蔽或吸收作用。高血脂会导致荧光猝灭，使得荧光信号强度降低。有研究表明，采用低温高速离心法可以有效去除脂血因素的干扰

(18) IgG：

① 性质: 免疫球蛋白

② 作用机制: 与单链DNA相互作用，抑制靶DNA与DNA聚合酶的结合，使得靶DNA不能与DNA聚合酶结合，而且当样本加热循环时，这种抑制作用会增强

(19) 其他抑制剂: 甘胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠、氯化铁、植物复杂多糖、黑色素、钙离子、胶原质等也可能在不同程度上抑制PCR反应。

标本中PCR抑制物来源及作用机制

标本中PCR抑制物的来源主要可以分为内源性和外源性两种，其作用机制则复杂多样，但大致可以归为2类。

1. 内源性抑制剂

某些样本中天然存在的物质，如血红素、免疫球蛋白、多糖、蛋白酶和核酸酶等，可以抑制DNA聚合酶的活性，从而影响PCR扩增效率。这些抑制剂通常来源于血液、组织、植物材料或微生物样本。细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、离子、胆盐、多糖等。

2. 外源性 抑制剂

在样本收集、处理或保存过程中引入的化学物质，如消毒剂(乙醇、异丙醇)、螯合剂(EDTA)、去污剂(SDS)、肝素抗凝剂、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物和盐类(氯化钠)等，也可能抑制PCR反应。

3. 抑制物作用机制

(1) 干扰核酸提取过程中的细胞裂解。

细胞裂解不完全，核酸不能有效释放则不会产生扩增，如煮沸法所释放的DNA有时并不能完全与结构蛋白或DNA-结合蛋白分离，从而出现扩增抑制作用。

(2) 降解或包裹核酸。

DNA一级结构不稳定，会因为水解、非酶甲基化、氧化损伤和酶降解等出现降解。细胞中存在核酸酶，如果核酸酶处理不干净，残留在核酸样本中，也会降解核酸。微生物如细菌产生的限制性内切酶也是一个降解DNA的因素。有些细菌的DNA酶属于热稳定的核酸酶，在扩增中期可水解基因组和引物DNA。

核酸和引物也因为其不能与DNA聚合酶结合而出现不扩增。如蛋白质、多糖、细胞碎片、脂类等对PCR的抑制作用，很可能就是通过对DNA的物理包裹作用而使其不能与聚合酶接触。乳胶手套上滑石粉对PCR扩增影响可能会通过其对DNA的非特异结合作用进行的。因为DNA可结合至玻璃、二氧化硅等上，这也是采用硅吸附方法提取核酸的基本原理。

(3) 热稳定的DNA聚合酶的失活。

① 临床上PCR抑制物主要有: 总胆红素、血红蛋白、IgG、甘油三酯和肝素等，这些物质来源于样本的中组分或处理样本过程中所产生，它们会降低模板的扩增效率，甚至造成低水平样本检测为假阴性结果。

② 逆转录抑制剂包括: SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗，可除去抑制剂。

PCR增强剂

PCR增强剂是可以改善PCR及PCR衍生技术的灵敏度、特异性、保真度等的一类添加剂。比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对PCR产生抑制。根据其作用和原理，大致可以分为3类：

1. 用于扩增高GC含量或具有复杂二级结构模板

1M 甜菜碱、1-10% DMSO、 1-5%甲酰胺、1-10%甘油对此类模板可以显著提高产量，但过量会抑制PCR反应。

(1) 甜菜碱：

甜菜碱是一种生物碱，化学名称为N,N,N-三甲基甘氨酸，化学结构与氨基酸相似，属季铵碱类物质，甜菜碱广泛存在于动植物体内。甜菜碱具有破坏富含GC的DNA序列的能力，可提高PCR扩增的产量和特异性。感兴趣的同学可以浏览这篇文章《 PCR实验中，除了Taq DNA聚合酶，缓冲液(Buffer)真的那么重要吗？Buffer要怎么优化呢？》。

(2) 二甲基亚砜(DMSO)：

DMSO是一种含硫有机化合物，具弱碱性，既溶于水又溶于有机溶剂，是常用的有机溶剂。

纯二甲基亚砜的

冰点

是18.45℃，含水40%的二甲基亚砜在-60℃不冻，而且二甲基亚砜与水、雪混合时放热。因此做汽车防冻液、刹车油、液压液组分提供了方便。

DMSO常做增效剂能够提高引物与模板间的亲和力，从而提升扩增的特异性。1%~10%DMSO(二甲基亚砜)就是一种常用的增效剂，能使PCR反应在较高温度下进行，有助于解决模板二级结构引起的问题。

2. 用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性

在PCR实验中，有那些因素影响了「PCR反应」？“全家桶”大礼包来袭！

正文

(1) SDS(十二烷基硫酸钠)：

(2) 苯酚：

(3) 乙醇：

(4) 异丙醇：

(5) 乙酸钠(NaAc)：

(6) 氯化钠：

(7) EDTA：

(8) 血红素：

(9) 氯高铁血红素：

(10) 丹宁酸( 鞣酸 )：

(11) 肝素：

(12) 尿素：

(13) 腐殖质：

(14) 胆酸盐(胆汁酸盐)：

(15) 胆红素：

(16) 血红蛋白：

(17) 高血脂：

(18) IgG：

(19) 其他抑制剂: 甘胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛黄胆酸钠、氯化铁、植物复杂多糖、黑色素、钙离子、胶原质等也可能在不同程度上抑制PCR反应。

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