circRNA现在研究并不算太热门，但是如果深入研究的话，也是能发表高分文章的。夏老师在PubMed上就看到了这么一篇文章，这篇是南方医科大学广东省人民医院的博士和主治医师发表在15.8分的Drug Resist Updat上的文章。这篇文章做的是circRNA影响GSDME的棕榈酰化，导致了焦亡的抑制，甚至还研究了circRNA上游的正反馈通路……给的是真多，做得也是真够细致的：
开局其实都差不多，他们就先对CRC（结直肠癌）的OXA（奥沙利铂）耐药和敏感的患者进行了二代测序，分析了差异表达的circRNA（下面的热图应该都能看懂的吧，在《夏老师带你读文献》里也介绍过，就是看总体差异表达情况的）。他们在这些差异表达的circRNA中，与其他GEO数据库中的数据进行交集，找到了circPDIA3，并且验证了circPDIA3的表达：
通过这样的筛选，找到了circPDIA3，于是他们假设circPDIA3可能是导致CRC耐药的关键分子。为了证明这一点，他们就需要对circPDIA3进行进一步的功能验证，也就是在体内外的敲减或者过表达验证，并同时分析circPDIA3在患者中的表达情况（其实这也就是柯霍氏法则的验证，首先验证circPDIA3的相关性，其次就是分析circPDIA3的表达与否，是否能引起OXA耐药的变化，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》）。结果显示circPDIA3会促进CRC细胞在体内、外的化疗耐药性：
既然circPDIA3是与OXA耐药有相关性的，那么circPDIA3的具体功能机制又是什么呢？他们这里并没有往ceRNA上进行研究，而是直接分析了circPDIA3能结合的蛋白，他们发现circPDIA3能结合GSDME（这个大家应该再熟悉不过了，这个就是和细胞焦亡密切相关的蛋白之一，被Caspase水解成N端和C端，然后N端进入细胞膜形成穿孔，不熟悉的话可以回去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列，复习下）。通过对GSDME的截段并与circPDIA3进行结合验证，他们确定了circPDIA3主要是结合在了GSDME的C末端：
那既然circPDIA3主要是结合了GSDME，也就是说circPDIA3可能会影响细胞的焦亡。他们首先发现，过表达circPDIA3能促进Caspase3对GSDME的水解切割，但是过表达circPDIA3却抑制了焦亡（这个要回去复习下细胞焦亡了，GSDME通过被Caspase3的水解，才能形成N端并上膜形成穿孔，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的焦亡那几章）。也就是说circPDIA3对焦亡的影响可能还有其他机制，接着通过验证他们发现，circPDlA3通过与GSDME-C结合，增加了GSDME-C与GSDME-N的相互作用。而GSDME-C与GSDME-N的互作，会抑制GSDME-N的活性，从而通过GSDME的自身抑制，阻遏了焦亡的产生：
那么circPDlA3与GSDME-C结合会造成什么样的影响呢？于是他们分析了能与GSDME-C结合的其他蛋白，他们假设可能是circPDlA3与GSDME-C结合，影响了GSDME-C与其他蛋白的结合，导致了后续的表型。他们通过分析发现了ZDHHC3 、ZDHHC17这俩棕榈酰化相关的蛋白，能与GSDME结合，而这种结合会导致GSDME的棕榈酰化。通过对GSDME-C蛋白上棕榈酰化位点的突变分析（这一步验证就很有效地验证了棕榈酰化的作用，这种验证的严谨性，不是简单粗暴地敲除ZDHHC3 、ZDHHC17能做到的，可以有效地避免肯定后件的逻辑谬误，这篇文章的严谨性就体现在这几个实验之中，不清楚肯定后件的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），他们确定GSDME-C的棕榈酰化，对于GSDME的C端与N端结合的起到了关键作用：
那么关键的来了，既然GSDME的棕榈酰化这么重要，这个和circPDIA3的关系又在哪里呢？是不是由于circPDlA3与GSDME-C结合才导致表型的呢？讲到这里，估计大家很可能会觉得就直接敲减circPDIA3来验证就行了咯，但实际上如果直接敲除circPDIA3，就犯了肯定后件的逻辑谬误，这就不严谨了（再次强调一下，研究的严谨性是一篇高分文章必须具备的，不是简单的敲除过表达就能验证的。不清楚肯定后件的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。他们就分析了circPDlA3与GSDME-C结合的关键位点，并对这几个位点进行了突变，普通的实验可能看看Luciferase就够了。但实际上不够，他们把OXA耐药作为最终的验证节点，而不是Luciferase的荧光，这就高出了其他circRNA文章很多了。由此他们确定circPDlA3与GSDME-C结合，才是circPDlA3引发耐药的关键：
其实做到这里，这篇文章的档次应该已经不低了。但他们还继续研究了circPDlA3的上游，分析了circPDlA3启动子上结合的转录因子。他们发现XBP1可以结合circPDlA3启动子，并激活circPDlA3转录：
而circPDlA3下游的miRNA，这里他们就又回到了ceRNA上，分析了circPDlA3的共表达基因，其中也有XBP1。这样就形成了一个正反馈通路，circPDlA3通过结合miRNA，促进XBP1的表达，而XBP1又促进了circPDlA3的转录：
最后他们用ASO-circPDlA3抑制circPDlA3，同时使用OXA对小鼠进行体内CRC治疗验证，发现抑制circPDlA3可以有效提高CRC的OXA敏感性：
最后他们形成了这样的示意图，首先是circPDlA3可以通过结合GSDME-C，阻止GSDME-C被ZDHHC3 、ZDHHC17棕榈酰化（棕榈酰化的GSDME-C无法结合GSDME-N），导致细胞焦亡被抑制。另一方面circPDlA3上游的XBP1，也会被circPDlA3下游的miRNA调控，从而形成了一个XBP1→circPDlA3→XBP1的正反馈通路：
这篇文章其实可以拆解成两部分，第一部分是circPDlA3的机制研究，这一部分研究在假设迭代的推进下，相当严谨，把整个circPDlA3阻碍焦亡的过程完整地呈现了出来。第二部分是circPDlA3自身表达的正反馈通路，这部分稍显仓促，但也形成了完整的一个反馈互动通路，也是不错的。总的来说，这篇文章就已经是10分+文章里，质量比较优秀的了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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