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专家点评Nature | 卢培龙团队从头设计跨膜荧光激活蛋白

BioArt · 公众号 · 生物 · 2025-02-20 00:12

正文

点评 | 许文青 （上海科技大学） 、刘海燕 （中国科学技术大学）

跨膜蛋白在细胞内外物质交换和信息传递中起着关键作用，是细胞维持正常生命活动及对环境信号做出响应所必需的。许多跨膜蛋白的生理功能依赖于与特定配体分子的相互作用。因此，探究跨膜蛋白与配体分子识别和结合的机制一直是生物学研究的重点课题。从头设计能够结合特定配体分子的跨膜蛋白，是蛋白质设计领域的重要目标之一。实现这一目标不仅在生物传感、分子检测等生物学工具的研发领域具有巨大应用潜力，还能深化我们对跨膜蛋白与小分子配体相互作用机制的认识，意义重大。

然而，由于膜环境与膜蛋白本身的复杂性，膜蛋白在表达、纯化和表征上面临诸多挑战，导致其在蛋白质结构数据库（PDB）中的结构数量相对较少。人们对膜蛋白折叠、定位和功能机制的理解不如水溶蛋白深入，因此跨膜蛋白的从头设计难度更大。由于小分子结合蛋白的从头设计问题尚未完全攻克，再加之跨膜蛋白骨架采样的局限性以及在疏水性膜环境中构建空腔和极性相互作用等挑战，使得精确设计能够特异性结合指定配体的跨膜蛋白成为一项悬而未决的难题。

2025年2月19日，西湖大学生命科学学院/西湖实验室 卢培龙 团队在 Nature 期刊上发表了文章 De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins ，首次报道了跨膜荧光激活蛋白的从头设计成果。这是首个通过从头设计得到的能够精确结合指定小分子的跨膜蛋白，实现了从头设计跨膜小分子结合蛋白的突破。

该研究整合了深度学习方法与基于能量的算法，从头设计了跨膜荧光激活蛋白tmFAP (transmembrane fluorescence-activating protein) ，首次实现了跨膜蛋白与配体分子在膜内的非共价相互作用的精确从头设计。设计的蛋白能够特异性结合目标配体HBC599荧光基团，亲和力达到纳摩尔级别，并使其荧光亮度激活超过1600倍，结合态的亮度和量子产率均优于常用的增强型绿色荧光蛋白EGFP。

两步法设计跨膜荧光激活蛋白

研究人员选择了转子型荧光分子HBC599作为目标配体分子，并围绕其展开了结合蛋白的从头设计。HBC599分子在游离状态下基本不产生荧光，只有当以特定构象被稳定结合后，荧光才会被高效激活。因此，选择HBC599作为目标配体分子可以通过荧光强度来直观且快速地检测其结合状态。

设计过程分为两步：首先，在从头设计的蛋白骨架内部构建配体分子的结合位点，得到水溶荧光激活蛋白（water-soluble fluorescence-activating protein，wFAP）；然后，在固定结合位点的情况下重新设计wFAP的序列，构建跨膜区，从而将其设计为跨膜荧光激活蛋白（tmFAP）。

设计水溶荧光激活蛋白

在设计wFAP时，研究人员首先使用基于螺旋参数的参数设计方法生成了四螺旋束的蛋白骨架。通过调整螺旋间的相对位置和扭转角度，在螺旋束中心构建了空腔结构，为放置配体结合口袋提供空间。然后，使用RIFdock 通过采样配体周围可能的侧链构象，设计了与目标配体相互作用的极性残基。随后，使用基于能量的Rosetta程序对剩余部分的序列进行多轮设计，优化了侧链堆积、配体相互作用和整体能量。由于小分子结合蛋白的设计对精度要求极高，研究人员将基于深度学习方法的AlphaFold2结构预测网络整合到设计流程中，大大提高了骨架采样的质量和效率。研究人员将设计得到的序列输入AlphaFold2以预测其三维结构，筛选出与设计模型高度一致的候选，并将其反馈至设计流程，更新设计模型的骨架坐标，进一步迭代设计，从而生成了稳定的预组织的结合口袋，得到了与预测结构高度一致的设计。

设计的wFAP蛋白能够结合配体荧光基团HBC599，荧光激活倍数达到了数百倍。通过定向进化进一步优化蛋白的侧链堆积和口袋中的静电性质后，荧光激活倍数提高到上千倍，荧光亮度和量子产率超过了常用的增强型绿色荧光蛋白EGFP。

设计跨膜荧光激活蛋白

跨膜荧光激活蛋白设计与表征

在设计跨膜版本的荧光激活蛋白（tmFAP）时，需要将wFAP蛋白的亲水表面改造为疏水表面，同时在蛋白核心内仍精确维持配体结合口袋结构。为此，研究人员基于AlphaFold2网络进行梯度引导的幻觉设计（hallucination），在固定核心配体结合区的同时，重新设计了wFAP的表面残基，生成了跨膜疏水区，使AlphaFold2预测的结构同时满足跨膜区疏水性、口袋稳定性和整体折叠置信度，从而得到了具有全新跨膜区序列的tmFAP蛋白。tmFAP能稳定存在于膜环境中，与wFAP蛋白在核心结构上几乎完全一致。

跨膜荧光激活蛋白冷冻电镜结构与设计模型高度一致

研究人员测试了tmFAP，发现其与wFAP具有相似的配体亲和力和荧光激活活性。经过进一步的定向进化优化后，得到的tmFAP与HBC599分子的亲和力达到了18 nM，荧光激活倍数超过1600倍。设计的wFAP和tmFAP能够特异性激活目标结构的配体荧光基团（HBC599），而不激活其他结构略有区别的化学类似物（如HBC530等）。tmFAP在活细胞中表达后能自发定位到大肠杆菌、爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞等不同类型细胞的膜组分上，且具有很高的荧光激活活性。研究人员解析了wFAP蛋白与HBC599配体复合物的高分辨率晶体结构以及tmFAP与HBC599配体复合物的冷冻电镜结构，证实与设计模型高度一致，验证了设计的准确性。

该研究采用深度学习方法，解决了设计跨膜区时引起的核心结构及配体结合口袋结构扰动问题，实现了小分子结合跨膜蛋白的精确设计，为跨膜蛋白的从头设计提供了新范式。该方法使小分子结合跨膜蛋白的设计不再依赖天然蛋白骨架，且可针对任意小分子进行设计，为定制化功能的跨膜蛋白从头设计奠定了基础，如转运体蛋白及配体门控离子通道等。此外，可以沿用设计 tmFAP 的思路，进一步开发可遗传编码的生物探针。在膜蛋白穿膜区设计荧光化学探针结合位点，使其响应膜两侧的物理或化学信号。这种生物探针不仅具有膜蛋白可控表达的组织和位置特异性优势，还兼具化学探针的高灵敏度和高信噪比特性，在检测跨膜电压和 pH 梯度等方面具有广阔的应用前景。

西湖大学博士生朱璟熠、梁明福、孙科为本文共同第一作者，西湖大学生命科学学院/西湖实验室研究员卢培龙为通讯作者。

专家点评

许文青 （上海科技大学，教授）

近年来，跨膜蛋白设计一直是结构生物学和合成生物学领域的一个难题。传统方法通常依赖于天然进化留下的模板或对已有蛋白进行改造，但在精确定制具备小分子结合功能的口袋方面，始终存在着如何在维持膜内整体稳定性的同时，实现对特异小分子进行精准识别的技术挑战。卢培龙团队在《De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins》一文中，通过融合经典能量优化方法与深度学习辅助结构预测，首次从头设计出能够非共价、高亲和力结合转子型荧光分子HBC599的跨膜蛋白，这一成果为小分子与膜蛋白相互作用的结构生物学和合成生物学研究提供了新的研究范式。

自然界中的膜蛋白，如信号分子膜受体以及重要代谢物的转运蛋白等，经过亿万年的进化，能够在确保膜内嵌稳定性的同时实现特定分子的高效结合，并发挥重要的功能。但如何利用理性设计方法重现或超越这种能力，则是一项极具挑战的任务。卢培龙团队的研究打破了这一技术瓶颈，证明了通过膜蛋白从头设计和整合结构生物学，可以在跨膜蛋白中实现小分子结合位点的高精度构建。这不仅为我们揭示了膜蛋白中小分子识别及其在构建具有特定信号传导、离子转运或催化功能的功能性膜蛋白的理论基础，还为我们提供了一个可高效从头设计跨膜蛋白与小分子相互作用的技术平台。

借助这一设计平台，可以定制开发出多功能的跨膜蛋白工具，例如用于细胞信号调控的传感器或作为靶向药物递送系统的关键元件。这一成果将在生物传感、细胞信号调控及靶向药物开发等多个前沿领域产生重要影响。同时，随着深度学习算法的不断完善和高分辨率结构解析技术的进一步发展，这一方法为其他跨膜蛋白的定制化设计提供了全新的思路和技术平台，有望在更多复杂跨膜蛋白的设计中发挥重要作用，推动该领域向着更加精准和多样化的方向发展。

专家点评

刘海燕 （中国科学技术大学，教授）

跨膜蛋白对小分子配体的识别在细胞信号传导和代谢中起着关键作用。许多重要的跨膜蛋白的功能都基于它们与小分子的相互作用，例如配体门控离子通道、GPCRs、转运蛋白等。要设计能结合特定配体的跨膜蛋白，需要高精度地在膜环境中形成功能位点。迄今为止，从头设计的跨膜蛋白仅限于通过配位键识别卟啉类分子，通过非共价相互作用结合小分子配体的跨膜蛋白设计仍罕有报道。

卢培龙团队在Nature报道的tmFAP设计中，结合深度学习和基于能量的方法，从头设计了通过结合配体小分子产生荧光的跨膜蛋白。研究人员以一个含荧光生色基团的小分子为目标配体，用参数化方法对能容纳结合口袋的四螺旋骨架进行采样，并使用深度学习方法进一步优化。同时，他们用物理能量引导序列的采样和优化，在稳定蛋白结构的同时加强与配体的相互作用。他们先测试了一系列水溶性蛋白来测试设计的蛋白-配体的结合口袋，再参照相应口袋设计了成功设计了跨膜蛋白tmFAP。蛋白的高分辨率晶体结构和冷冻电镜结构验证了蛋白结构以及配体分子结合模式与设计模型高度一致。

这项工作展示了使用深度学习方法在生物膜内准确构建功能位点的巨大前景。在设计时通过结构生成-结构预测过滤的迭代循环，可以将水溶性蛋白的功能位点结构准确地迁移到跨膜蛋白上。该设计策略可以扩展到在不同拓扑结构的跨膜蛋白中构建活性位点。最近公开的AF3模型进一步提高了蛋白-小分子复合物建模能力，将其整合到设计流程中后能进一步提高设计精度和效率。这项工作为开发基于跨膜蛋白的新型成像或传感工具铺平了道路。

卢培龙团队简介及招聘信息

卢培龙，西湖大学生命科学学院/西湖实验室特聘研究员，主要研究方向为蛋白质设计，进行合成生物学、生物物理学与计算生物学多学科交叉研究。主持科技部重点研发计划（合成生物学青年项目）与国家自然科学基金委等科研项目。在Nature，Science，Cell Research等期刊以通讯作者或第一作者身份发表论文30余篇。卢培龙团队致力于蛋白质设计这一多学科交叉领域的研究，主要研究内容包括：

（1）重大疾病相关膜蛋白质的拮抗蛋白质设计：拮抗蛋白质主要靶向作用于离子通道蛋白以及膜受体蛋白特定区域，并调控其生理功能。

（2）为解决重大生物学问题设计新型蛋白质工具。

（3）功能性膜蛋白质设计：主要包括新型跨膜纳米孔蛋白质、新型离子通道、以及新型膜受体的人工设计。

团队有多个助理研究员、博士后和科研助理职位虚位以待。期待共同为蛋白质设计这一新兴领域的发展作出贡献！联系方式： [email protected]

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-025-08598-8

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