多层次活性氧调节水凝胶能够恢复衰老骨骼的修复活力

随着全球老龄化加剧，老年人骨缺损已成为公共医疗保健的重大挑战。改善老化微环境和衰老干细胞，以激活骨再生，是治疗这一问题的潜在有效方法 。活性氧 （ ROS ）被证明是细胞衰老的关键因素之一。在衰老细胞中，线粒体受损导致 ROS 增多 。自噬能力不足和抗氧化酶失活，使得衰老细胞中过量 ROS 的清除不足，从而引发氧化应激，不断损害蛋白质、脂质、 DNA 等成分。 除了细胞内 ROS （ inROS ） 外，老年相关的铁积累还会增加游离羟基自由基 （ ·OH ） 在细胞外微环境中，进而提升衰老细胞外的 ROS （ exROS ）水平 。细胞内和细胞外微环境衰老共同导致并降低骨间充质干细胞 （ BMSC ） 的成骨能力。

近期，来自华东理工大学刘昌胜教授团队提出一种旨在减少 inROS 和 exROS 积累，抑制衰老 BMSC 中 ROS 产生的方法。研究人员建立了一个多层次的 ROS 调节系统，根据以下基本原理解决衰老骨骼再生的要求： a) 对活性氧具有高度敏感性并能减少过量的细胞内活性氧（ inROS ）； b) 提高清除细胞外活性氧（ exROS ）的效率； c) 增强并持续保持抗氧化能力，以维持活性氧产生与清除之间的平衡； d) 通过清除活性氧使衰老细胞功能恢复活力； e) 具有适用于老化骨骼再生的适应性特性。 为了验证本方法，研究人员开发了一种聚乙二醇化聚合物（癸二酸甘油酯）（ PEGS-NH2 ） / 聚（ γ- 谷氨酸）（ γ-PGA ）水凝胶 （ PEGS-PGA ），载有含有雷帕霉素 （ R ） 的聚（二硒化物 - 碳酸酯）纳米胶束 （ Se ）（图 1 ）。二硒键对活性氧（ ROS ）表现出高度敏感性，使其成为应对老化复杂再生环境的理想选择 。两亲性聚合物 mPEG-b-P （ TMC-co-MSeSe ），它可以自组装成纳米胶束 （ Se ） 并作为 inROS 的有效清除剂和药物（雷帕霉素）载体。细胞内释放 R 诱导衰老细胞的自噬活性，促进消除受损的线粒体并防止 ROS 的产生，以及通过 mTOR 通路抑制细胞衰老。此外， R 具有诱导 BMP/Smad 通路激活的能力，从而促进干细胞的成骨分化。为了在衰老骨缺损中为 SeR 纳米胶束提供稳定的环境，设计了 PEGS-PGA （ P ） 水凝胶来加载 SeR 并维持 exROS 。 P 水凝胶可以很容易地注射到骨缺损部位，并且可以实现原位交联以实现老化的骨再生。 P 水凝胶为长期再生提供了理想的手术操作和机械支撑，主链上丰富的羧基 （ –COOH ） 可防止 ·OH 通过高效的 Fe 离子络合物形成，从而去除 exROS 。

首先，研究人员验证了 mPEG-b-P （ TMC-co-MSeSe ） 共聚物自组装成球形的能力，形成了均匀的 SeSe 纳米胶束（图 2d ），负载雷帕霉素 （ Rapa ）达到了 78.337% ± 3.988% 的包封效率。接下来，研究人员测试了 SeR 纳米胶束对 H ₂ O ₂ 的反应能力，结果表明 98% 的 Rapa 能够在 15 分钟内释放（图 2g ）。此外，研究人员还发现纳米胶束的尺寸随着 H ₂ O ₂ 的增加而不断增加，最终导致胶束破裂。这些结果表明，即使在低 H ₂ O ₂ 下， SeR 胶束对 ROS 也具有高灵敏度和响应性，从而为多层次结构 ROS 调节奠定了基础。

接下来研究人制备了具有高浓度羧基的可注射 PEGS 水凝胶，以促进 SeR 纳米胶束的局部给药。激光共聚焦 3D 成像证实了 SeSe/FITC 胶束在整个 P 水凝胶中的均匀分布（图3c ）。此外， PSeR 水凝胶表现出卓越的可注射性和良好的组织粘附性（图 3d ）。 SeSe 纳米胶束的引入不影响 PEGS-NH 的结构。这些结果突出了可注射 PSeR 水凝胶对衰老骨骼再生的显著益处，特别是易于手术操作和微创性，这大大降低了手术过程中感染的风险和对老年人术后恢复的影响。

过量的氧化应激在诱导细胞衰老中起重要作用，损害了 BMSC 的成骨分化能力。研究人员通过条件培养基中处理， 证实了复合水凝胶可以有效去除衰老 BMSCs 中过量的 inROS （图 4d，e ）。同时还通过 JC-1 荧光染色评估了线粒体功能、定量实时聚合酶链反应 （ qRT-PCR ） 分析 1 型沉默信息调节因子 （ Sirt1 ） 和超氧化物歧化酶 2 （ Sod2 ） 的水平，表明 PSeR 水凝胶可能通过上调抗氧化基因来增强衰老 BMSCs 对氧化损伤的抵抗力（图 4g，h ）。这些实验阐明了衰老干细胞功能恢复的底层逻辑。 PSeR 通过中断涉及线粒体功能障碍、 ROS 过度产生和抗氧化降解的恶性循环，为衰老干细胞创造了更有利的 “ 呼吸 ” 环境。

接下来，研究人员将 PSeR 水凝胶与衰老 BMSC 一起孵育，观察到衰老相关的 β- 半乳糖苷酶 （ SA-β-gal ） 活性降低， p16 和 p53 表达降低（图 5a、c ） 。此外，在 PSeR 处理中， SASP 表达显著下调（ 图 5b ）。碱性磷酸酶 （ ALP ） 和茜素红 S （ ARS ） 染色同样反应了 SeSe 纳米胶束和 Rapa 恢复了衰老 BMSCs 的成骨功能。

最后，研究人员建立了股骨远端缺损模型研究 PSeR 水凝胶对衰老 BMSCs 体内 ROS 清除的调节作用，结果表明复合水凝胶有效减轻了 ROS 积累。 通过免疫荧光染色分析， PSeR 组内 p16 （绿色荧光） 和瘦素受体 （ LepR; 红色荧光） 双标记的衰老 BMSC 比例明显下降。同时用 PSeR 治疗后，衰老小鼠的骨缺损再生率提高了 120% ，表明骨愈合有显著改善（图 6b ）。这些研究结果表明， ROS 的多层次调节增强了老年骨缺损的再生微环境，加快了愈合过程。

综上所述，本研究通过组装含有负载雷帕霉素 （ PSeR ） 的聚（二硒化物 - 碳酸酯）纳米胶束的可注射水凝胶，开发了一种多层次结构 的 ROS 清除系统。这有效地消除了细胞内 ROS 积累，并在整个衰老骨骼修复过程中保持了良好的细胞外氧化环境。此外，通过 ROS 的多层次结构调控，成功干预骨髓间充质干细胞衰老。这项研究为促进治疗退行性相关疾病的治疗概念提供了有价值的见解。

本研究由来自华东理工大学Yan zhang、Yuan Yuan和刘昌胜教授团队完成，并于 2024 年 10 月 17 日在线发表于 Advanced Materials 。

文献信息： Z. He, C. Sun, Y. Ma, X. Chen, Y. Wang, K. Chen, F. Xie, Y. Zhang*, Y. Yuan*, C. Liu*, Rejuvenating Aged Bone Repair through Multihierarchy Reactive Oxygen Species-Regulated Hydrogel.  Adv Mater 2024, 36：2306552.

供稿：高仕杰

审校：秦天

编辑：李凯华