慢性骨髓白血病（CML）主要致病因素是BCR-ABL酪氨酸激酶的持续活化。虽然临床上治疗手段已有大幅提高，但是化疗抵抗目前仍然是普遍存在的问题。因此，在慢性骨髓白血病治疗上，寻找新的治疗策略是急需的。
MicroRNAs作为非编码RNA的排头兵，在各类肿瘤癌症中都有较多研究，其在白血病的研究中也多有涉及。PI3K/Akt通路是经典的耐药通路，在非小细胞肺癌耐药机制研究中占有重要地位。
但是PI3K/Akt通路在白血病耐药研究中并不多见。今天米粒儿跟大家分享一篇miRNA联合经典耐药通路PI3K/Akt解决白血病耐药问题的研究。
题目：Functional screen analysis reveals miR-3142 as central regulator in chemoresistance and proliferation through activation of the PTEN-AKT pathway in CML.（回复20170706可下载文献。）
本文作者采用miRNA表达，miRNA靶点，表型，通路，回复实验和体内验证6个步骤探讨miRNA介导CML耐药机制。
（1）作者报道了miR-3142在ADR-抵抗的K562/ADR细胞和CML患者外周血中过表达。
（2）通过数据库预测方法初步确定靶点PTEN，并采用双荧光报告实验等手段验证数据库预测结果。
（3）在表型实验阶段，分别过表达和沉默miR-3142，检测细胞增殖能力和对ADR敏感性。
（4）在表型实验基础上，引入PI3K/AKT通路，探讨miR-3142表达对PI3K/AKT通路影响。
（5）通过rescue实验，进一步验证miR-3142靶向PTEN影响细胞增殖能力和对ADR敏感性。
（6）体内实验验证miR-3142影响肿瘤增殖。
这篇论文涵盖组织，细胞、分子、动物4个水平，涉及分子（miRNA）， 通路（PI3K/Akt），靶点（PTEN），并且验证实验之多几乎是miRNA研究的顶级配置，这是发在Cell Death and Disease（IF=5.965）的底气所在。
然而米粒儿还是想从鸡蛋里挑点儿骨头。这篇论文从数据呈现方式上还可以进一步改进。众所周知，PTEN是PI3K/Akt的上游分子，本文作者在Step 2展示靶点PTEN后， 在Step4顺理成章的引出PI3K/Akt通路。从说理角度来讲，数据呈现方式合理。
但是却割裂了靶点PTEN发现和rescue实验结果，并且将表型穿插在靶点和通路之间，从思路上来讲存在断点，理解稍有困难。如果将顺序改为miRNA表达，表型，通路，miRNA靶点，回复实验和体内验证更有利于读者理解。
下边仔细为大家批讲主要内容，读完之后也可以思考一下，如果我自己得到这些数据，会如何呈现给审稿人和读者呢？
miR-3142在ADR抗性细胞株中表达明显升高
作者前期采用miRCURYTM LNA Array对K562和K562/ADR细胞系进行筛选，发现miR-3142在K562/ADR细胞中表达显著升高。作者采用qPCR方法分别在K562，KU812和外周血单核细胞中对上述结果进行验证，结果表明在以上3个体系中，ADR抗性的细胞中miR-3142表达都明显升高。
PTEN是miR-3142靶点
作者分别采用TargetScan，PicTar和miRNA.org数据库预测miR-3142的靶点，结果显示PTEN是miR-3142理论上的靶基因。为了验证这一结论，作者采用双荧光报告系统检测miR-3142是否特异性靶向结合PTEN 3’-UTR。
结果显示miR-3142转染可显著降低荧光活性。而当PTEN 3’-UTR区域突变后，荧光活性不变，以上结果表明miR-3142可靶向结合PTEN。
紧接着，作者在CML患者和CML细胞中分别检测PTEN表达水平。在CML患者和CML细胞中，PTEN表达量都显著降低。且miR-2142与PTEN的表达量呈现明显的负相关。此外，作者分别转染miR-3142和Anti3142，发现miR-3142显著降低PTEN水平，而Anti3142可增加PTEN水平。
miR-3142高表达增强抗药性，促进细胞增殖
miR-3142高表达细胞中，IC50显著增加，凋亡比例降低。凋亡相关分子cleaved caspase和cleaved PARP表达量降低。OD值增加，克隆形成能力增强。
而当转染Ant3142，即miR3142表达降低后，实验结果与上述相反。
PI3K/AKT信号通路参与miR-3142调节的耐药和细胞增殖调节
Akt是PTEN重要的下游分子且参与肿瘤发展，细胞生存和增殖调节。外源表达miR-3142之后，p-Akt表达上升，而敲除miR-3142之后，p-Akt表达下降。
此外，作者还检测了PTEN下游通路基因p21，p27等的表达。结果显示miR-3142过表达时，p21，p27表达下降，而cyclin D1表达升高。在miR-3142敲除的细胞中，实验结果刚好相反。
而当采用Akt抑制剂LY294002或者shAkt技术干扰Akt表达之后，细胞增殖能力降低，凋亡比例升高，克隆形成能力降低。
以上结果表明，miR-3142通过激活PI3K/AKT通路调节药物抗性和细胞增殖。
此外，为了探寻PTEN表达抑制是否对miR-3142引发的细胞生存有重要影响。作者分别在K562/ADR中转染了PTEN质粒和敲除PTEN，结果显示PTEN过表达之后，抑制细胞增殖，药物敏感性增加。而敲除PTEN后，效应相反。
进一步的，在miR-3142过表达的细胞中，重新表达PTEN后可抑制细胞增殖，提高凋亡比例。相反的在miR-3142沉默的细胞中，敲除PTEN后，可促进细胞增殖，降低凋亡比例。这些数据表明,miR-3142调节的药物抗性和细胞增殖中，PTEN表达下降发挥重要作用。
体内实验验证miR-3142影响生长
为了进一步验证miR-3142对CML细胞药物敏感性和细胞增殖能力的影响，作者进行了动物实验。在miR-3142低表达的Anti3142组，肿瘤体积明显降低。而且Anti3142和ADR联合处理组，肿瘤增殖能力大大抑制。Anti3142组中，肿瘤重量也明显降低。
此外，Anti3142组中Ki67表达下降。而且PTEN表达水平升高。这些结果均表明抑制miR-3142可抑制肿瘤增殖。
