冷冻电镜，是用于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)，可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。冷冻电镜兴起于2013年，在
2017
年
10
月
4
日，瑞典皇家科学院宣布
2017
年度诺贝尔化学奖授予对冷冻电镜技术发展做出原创性贡献的
3
位科学家，他们分别是瑞士洛桑大学的退休荣誉教授
Jacques Dubochet
、美国哥伦比亚大学的
Joachim Frank
教授和英国剑桥
MRC
分子生物学实验室的
Richard Henderson
教授。
现在，冷冻电镜逐渐被大家熟知，在国内有不少高校引进了整套冷冻电镜系统(
据透露，最近上海科技大学引进了5台冷冻电镜
)，尤其以清华大学在冷冻电镜领域走在了全球的最前沿，在2019年（截至2019年8月23日），清华大学以冷冻电镜为技术，共发表了16篇
Cell
，
Nature
及
Science
文章：颜宁4篇，施一公3篇，柴继杰3篇，李雪明2篇，
周强1篇，杨茂君1篇等。具体的16篇文章，iNature进行了系统介绍：
【1】2019年1月1日，施一公研究组在
Nature
在线发表题为“
Structural basis of Notch recognition by human γ-secretase
”的研究论文，该论文报告人类γ-分泌酶与Notch片段的复合物的
冷冻电子显微镜结构
，分辨率为2.7Å。Notch的跨膜螺旋被PS1的三个跨膜结构域包围，并且Notch片段的羧基末端β-链形成β-折叠，其在细胞内侧具有两个底物诱导的PS1的β-链。杂合β-折叠的形成对于底物裂解是必需的，其发生在Notch跨膜螺旋的羧基末端。PS1在底物结合后经历明显的构象重排。这些特征揭示了Notch识别的结构基础，并且对γ-分泌酶对淀粉样蛋白前体蛋白的募集具有意义（
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）；
【2】2019年1月11日，
清华大学
施一公团队在
Science
在线发表题为“
Recognition of the amyloid precursor protein by human γ-secretase
”的研究论文，该论文报告了人类γ-分泌酶与跨膜APP片段的复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，分辨率达到2.6Å。 该结构用作发现γ-分泌酶的底物特异性抑制剂和理解γ-分泌酶的生物学功能以及AD的疾病机制的重要框架（
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）；
【3/4】2019年2月15日，原清华大学
颜宁团队
Science
背靠背同期发表2篇论文，发表发表题为“
Structures of human Nav1.7 channel in complex with auxiliary subunits and animal toxins
”及“
Molecular basis for pore blockade of human Na+ channel Nav1.2 by the μ-conotoxin KIIIA
”，共同阐述离子通道结构（
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）；
【5】2019年3月13日，西湖大学周强团队（第一单位清华大学）在
Nature
在线发表题为“
Structure of the human LAT1–4F2hc heteromeric amino acid transporter complex
”的研究论文，
该研究阐明了LAT1-4F2hc复合体的结构，并提供了对其功能及其可能与疾病相关的机制的见解（
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）；
【6】2019年3月13日，清华大学陈柱成/李雪明及中科院物理所李明共同通讯在
Nature
在线发表题为的"
Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by Snf2
"的研究论文，该研究解析了不同核苷酸状态下Snf2-核小体复合物的冷冻电镜结构，揭示了染色质重塑的机理（
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）；
【7】
】
2019年3月14日，施一公研究组在
Cell
在线发表题为“
Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching
”的研究论文，
该研究得到了
酿酒酵母的两种不同前mRNA上组装了B *复合物，并确定了四种不同B *复合物的冷冻EM结构，总分辨率为2.9-3.8Å。
U2核小RNA（snRNA）和分支点序列（BPS）之间的双链离散地远离5个B *复合物中的5'-剪接位点（5'SS），其缺乏步骤I剪接因子Yju2和Cwc25。将Yju2募集到活性位点使U2 / BPS双链体进入5'SS附近，BPS亲核试剂位于距催化金属M24Å处。该分析揭示了Yju2和Cwc25在分支中的功能机制。
不同前mRNA上的这些结构揭示了在主要功能状态下剪接体的底物特异性构象。 这些构象状态的比较揭示了对支化反应的机理见解（
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）；
【8】2019年6月14号，清华大学生命科学学院杨茂君
Science
杂志发表题为“
Cryo-EM structure of the mammalian ATP synthase tetramer bound with inhibitory protein IF1
”的研究论文，通过高性能冷冻电镜技术，解析了分子量高达280万道尔顿的哺乳动物ATP合酶四聚体6.2埃的结构，以及完整的（19种亚基）、两种状态的ATP合酶单体3.34埃和3.45埃结构（
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）；
【9】2019年5月30日，颜宁（清华大学为第一通讯单位）及吴建平共同通讯在
Cell
在线发表题为“
Molecular Basis for Ligand Modulation of a Mammalian Voltage-Gated Ca2+ Channel
”的研究论文
，
该研究报告了Cav1.1与
拮抗药物硝苯地平，地尔硫卓和维拉帕米的复合物
的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，分辨率分别为2.9Å，3.0Å和2.7Å；
Cav1.1与
DHP激动剂Bay K 8644
复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构
，分辨率为2.8Å
（
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）；
【10】
清华大学Liu Xiangyu及斯坦福大学Brian K. Kobilka共同通讯在
Cell
发表题为“
Structural Insights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation
”的研究论文，该研究
提出了与Gαs的羧基末端14个氨基酸复合的β2AR结构以及GDP结合的Gs异源三聚体的结构。这些结构为β2AR和Gs之间的交替相互作用提供了证据，
同时提出β2AR的活性结构仅由GsCT的14个氨基酸稳定。该结构可以代表无核苷酸的β2AR-Gs复合物形成中的构象中间体，并揭示G蛋白活化的动态过程
（
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）
；
【11/12】2019年4月4日，
清华大学
柴继杰课题组、中科院遗传发育所
周俭民课题组和清华大学王宏伟课题联合
同期背靠背发表两篇重量级
S
cience
文章，
完成了植物NLR蛋白复合物的组装、结构和功能分析，揭示了NLR作用的关键分子机制，是植物免疫研究的里程碑事件。两篇文章
分别是
：
"Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex
”
的研究论文。该研究通过重建了拟南芥中NLB蛋白ZAR1-RKS1和ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物，并分别以3.7和4.3Å的分辨率确定了它们冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，
揭示了ZAR1-RKS1识别PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的机制
，为理解NLR蛋白提供了结构模板
！
"Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity
”
的研究论文。该研究重建了
ZAR1-RKS1-PBL2UMP-dATP活性复合体，证明了其复合体在免疫激活过程中进行寡聚化，并揭示了其激活免疫反应的机制
！这两项研究
在植物免疫研究领域取得历史性的重大突破，填补了人们25年来对植物抗病蛋白认知的巨大空白，将为研究其它抗病蛋白提供范本
。
Science杂志同期发表评论文章，认为
“首个抗病小体的发现，为植物如何控制细胞死亡和免疫提供了线索”“显著推进了人们对植物免疫机制的认识”“打开了多个开拓性研究方向”
（
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）；
【13】2019年7月5日，原清华大学颜宁（清华大学第一单位）等人
Nature
在线发表题为“
Modulation of cardiac ryanodine receptor 2 by calmodulin
”的研究论文，该研究报道了RyR2的8个冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，它们共同揭示了不同形式CaM的分子识别特征，并提供了对CaM对RyR2通道门控的调节的见解。Apo-CaM和Ca2 + -CaM结合由手柄，螺旋和中心区域形成的细长裂缝中的不同但重叠的位点。RyR2上CaM结合位点的转变受Ca2 +与CaM结合而不是RyR2的控制。Ca2 + -CaM诱导各个中心结构域的旋转和域内移位，导致PCB95和Ca2 +激活的通道的孔闭合。相比之下，
ATP，咖啡因和Ca2 +激活通道的孔在Ca2 + -CaM存在下保持开放，这表明Ca2 + -CaM是RyR2门控的许多竞争调节剂之一
（
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）；
【14】2019年7月10日，清华大学柴继杰与东安格利亚大学Cyril Zipfel共同通讯在
Nature
在线发表题为“
Mechanisms of RALF peptide perception by a heterotypic receptor complex
”的研究论文，该研究报道RALF23诱导CrRLK1L FERONIA（FER）和LORELEI（LRE）-LIKE GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL（GPI）-ACHORED PROTEIN 1（LLG1）之间的复合物以调节免疫信号。该研究工作揭示了GPI锚定蛋白与植物遗传学上不相关的RK一致的植物肽感知的意外机制，
这提供了一个分子框架，通过CrRLK1L RK和GPI锚定 的LRE / LLG家族蛋白质之间的不同异源复合物的感知，提供了一种分子框架来理解RALF多肽如何调节多个过程
（
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）；
【15】2019年8月2日，清华大学隋森芳，中国科学院植物所匡廷云及沈建仁共同通讯在
Science
发表题为“
The pigment-protein network of a diatom photosystem II–lightharvesting antenna supercomplex
”的研究论文，该研究报道了来自
中心硅藻-角毛藻（Chaetoceros gracilis）的光系统II（PSII） - 岩藻黄素（Fx）叶绿素（Chl）a / c结合蛋白（FCPII）超复合物的冷冻电子显微镜结构。
超复合物包含两个原体，每个原体在PSII核心周围具有四个四聚体和六个单体FCPII，其在腔表面含有五种外源氧进化蛋白。该结构揭示了巨大的色素网络的排列，有助于硅藻中有效的光能收集，转移和消散过程。
该成果是该合作团队在前期红藻、绿藻的光合膜蛋白结构与功能研究工作的拓展，为阐明硅藻PSII-FCPII超级复合体中独特的光能捕获、传递和转化以及高效的光保护机制提供了重要基础，为揭示PSII复合体的进化演变提供了重要线索。
该成果也为PSII的超快动力学、理论计算和人工模拟光合作用研究提供了新理论依据，同时为后续指导设计新型作物、提高作物的捕光和光保护效率提供了新思路（
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）；
【16】
2019年8月21日，清华大学
肖百龙
与
李雪明共同通讯在
Nature
在线发表题为“
Structure and mechanogating of the mammalian tactile channel PIEZO2
”的研究论文，
该研究
确定了全长2,822残基小鼠PIEZO2的同源三聚体结构，分辨率为3.6-3.8Å，揭示了38个跨膜螺旋的完全分辨的拓扑结构和具有跨膜和胞质收缩位点的完全闭合的孔。
PIEZO2与其同源物PIEZO1之间的结构比较表明，跨膜收缩位点可能充当由帽结构域控制的跨膜门。总之，
该研究提供了对压电通道的结构和机械化机制的见解。
1.人γ-分泌酶识别Notch的结构基础
γ-分泌酶对Notch的异常切割，会导致几种类型的癌症，但γ-分泌酶如何识别其底物仍然未知。在这里，施一公研究组报告人类γ-分泌酶与Notch片段的复合物的
冷冻电子显微镜结构
，分辨率为2.7Å。
Notch的跨膜螺旋被PS1的三个跨膜结构域包围，并且Notch片段的羧基末端β-链形成β-折叠，其在细胞内侧具有两个底物诱导的PS1的β-链。杂合β-折叠的形成对于底物裂解是必需的，其发生在Notch跨膜螺旋的羧基末端。PS1在底物结合后经历明显的构象重排。这些特征揭示了Notch识别的结构基础，并且对γ-分泌酶对淀粉样蛋白前体蛋白的募集具有意义。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-018-0813-8
2.人γ-分泌酶识别淀粉样蛋白前体蛋白
阿尔茨海默病（AD）的标志是AD患者脑中存在淀粉样蛋白斑。淀粉样斑块的主要成分是源自淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的β-淀粉样肽（Aβ）。I型跨膜蛋白APP首先被α-或β-分泌酶切割，分别产生83或99个残基的跨膜片段（APP-C83或APP-C99）。然后APP-C99通过其内肽酶活性被γ-分泌酶切割，产生48-残基肽Aβ48或49-残基肽Aβ49。随后通过γ-分泌酶的羧基末端肽酶活性切割Aβ49导致产生Aβ46，Aβ43和Aβ40的产生。类似地，Aβ48的切割产生Aβ45，Aβ42和Aβ38。其中，Aβ42和Aβ43特别容易聚集并形成淀粉样蛋白斑。除APP外，Notch受体也是α-和γ-分泌酶的底物。在α-分泌酶切割后，所得的跨膜Notch片段被γ-分泌酶切割以产生细胞内信号传导结构域。
人γ-分泌酶包含四个亚基：早老蛋白（PS），PEN-2，APH-1和nicastrin。作为γ-分泌酶的催化亚基，早老素是具有两个催化Asp残基的天冬氨酰蛋白酶，并且具有两种同种型PS1和PS2。在γ-分泌酶组装期间，PS1经历自身蛋白水解以产生氨基末端片段（NTF）和羧基末端片段（CTF）。PEN-2是γ-分泌酶成熟所必需的; APH-1稳定复合物和nicastrin被认为在底物结合中发挥作用。已经在PS1中鉴定了200多种AD相关突变，其中大多数导致Aβ42/Aβ40比率升高。
普遍存在的淀粉样蛋白假说假定淀粉样蛋白寡聚体直接促成AD的发展，使γ-分泌酶的抑制成为AD治疗的潜在治疗策略。不幸的是，也许是因为它们也抑制Notch切割，γ-分泌酶抑制剂会引起严重的副作用，而对AD患者没有任何明显的临床益处。在这里，施一公报告人类γ-分泌酶与跨膜APP片段的复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，分辨率达到2.6Å。PS1和底物之间的β-折叠对于γ-分泌酶的蛋白水解活性是必需的。该结构与γ-分泌酶 - Notch复合物的结构比较揭示了可用于开发底物特异性抑制剂的不同特征。
与淀粉样蛋白前体蛋白结合的人γ-分泌酶的结构为γ-分泌酶连续底物切割的螺旋解旋模型提供了强有力的支持。更重要的是，该结构允许通过γ-分泌酶比较APP和Notch识别以及AD相关突变的合理化。因此，该结构用作发现γ-分泌酶的底物特异性抑制剂和理解γ-分泌酶的生物学功能以及AD的疾病机制的重要框架。
原文链接：
http://science.sciencemag.org/content/early/2019/01/08/science.aaw0930?rss=1
3.含辅助亚基和动物毒素的人源Nav1.7通道复合体结构
在人电压门控钠(Nav)通道的九种亚型中，由SCN9A编码并在外周感觉神经元中高表达的Nav1.7与疼痛综合征有直接关系。
Nav1.7的突变出现在许多疼痛综合征中，包括极度疼痛障碍等。
Nav1.7的精确结构模型将有助于这一有前途的目标的药物发现。
真核细胞人Nav通道具有较高的序列相似性。
昆虫、电鳗和人类具有代表性的NaV通道的冷电镜结构揭示了核心α亚基的相同结构。
一个单一的多肽链，即α亚基，折叠成4个同源重复序列，每个重复包含6个跨膜螺旋，命名为S1-S6。每个重复序列中的S1-S4片段构成电压传感域(VSD)，它附着在由S5和S6螺旋所包围的中心离子导电孔域(PD)上。VSD和PD段符合在电压门控离子通道(VGIC)超家族中流行的规范域交换组装。S5和S6之间的序列包括选择性过滤器(SF)，它被两个半膜穿透的再入孔螺旋P1和P2夹在一起。
四个重复序列(Asp/Glu/Lys/Ala(DEKA)中相应的SF位点上的四个不同的残基是Na选择的特征基序。
虽然α亚基本身就足以用于离子渗透的电压依赖性门控，但它受一个或多个β辅助亚基的调节。所有四个β亚基，即β1-β4，都会影响Nav1.7的通道特性，尽管β1和β2通常与Nav1.7α亚基共同表达以进行生物物理表征。电鳗和人类的Nav1.4-β1复合物的结构揭示了α与β1之间的相互作用细节，但其他β亚基的结合模式仍有待于结构上的阐明。
在这里，研究人员报道了人源Nav1.7-β1-β2复合物与孔阻滞剂和门控改性剂毒素(GMT)结合的冷冻电镜结构，其中河豚毒素与原毒素-Ⅱ结合，Saxitoxin与Huwentoxin-IV结合，整体分辨率达到3.2 Å。除了VSDII的小位移外，这两种结构几乎相同，VSDII的S3-S4连接器以类似的方式容纳这两个GMT。另外一种原毒素-II位于VSDIV中S3-S4链接器的顶部。这些结构可能代表一种灭活状态，所有四个VSD“向上”和细胞内的门关闭。
这些结构说明了机械理解Nav1.7的功能和疾病的途径，并为结构辅助止痛药的发展奠定了基础。
原文链接：
http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/13/science.aaw2493
4.μ-圆锥毒素KIIIA阻断人源Na通道Nav1.2的分子基础
电压门控钠(Nav)通道负责动作电位的快速上升，因此在细胞膜兴奋性和电信号传递中起着至关重要的作用。
NAV通道复合体通常由一个由SCNxA编码的核心α亚基(x=1-5对应于Nav1.1-NaV1.5，x=8-11，对应于Nav1.6-Nav1.9)和一个或两个辅助β亚单位组成。当α亚基足够用于电压传感和离子选择性电导时，β亚基调节α亚基的膜定位，调节Na电流的峰值，改变电压依赖性通道激活和失活的动力学。β亚基包括一个氨基(N)末端免疫球蛋白(Ig)结构域、一个单跨膜螺旋(TM)和一个胞内结构域，β1和β3通过非共价相互作用与α结合，而β2和β4分别与α(6-10)形成二硫键。
来自电鳗和人类Nav1.4与β1的复合物的结构显示界面在这两个物种之间是保守的。
洞察其他β亚基的识别主要来自诱变分析和个体β亚基的结构信息。
除了β亚基外，NAV通道还受到各种动物毒液中大量天然毒素的调节。通常有两类毒素，孔阻滞剂和门控改性剂毒素(GMT)。前者以胍类神经毒素河豚毒素(TTX)和Saxitoxin(STX)为例，直接阻断离子电导。后者通常是长度从几个残基到几十个残基的肽，与电压敏感域(VSD)结合，改变通道的电压依赖的门控特性。一些肽类毒素，例如从锥形蜗牛中鉴定出的μ-圆锥毒素，也起着孔隙阻滞剂的作用。
与小分子孔道阻滞剂相比，肽类阻滞剂具有更严格的NaV亚型特异性，因此由于NAV通道的病理生理意义，代表了药理学意义的线索。
昆虫Nav通道NavPaS的结构与TTX、STX和GMT，Dc1a相互配合，揭示了这些具有代表性的毒素的识别和作用方式的分子基础。在本文中，我们介绍了β1和β2亚基的配合物Nav1.7的结构，以及(1)GMTs Pro毒素II(ProTxII)和TTX(Nav1.7-PT)和(II)Huwentoxin-IV(HWTX-IV)和STX(Nav1.7-HS)的结构。然而，
关于NAV通道与肽类孔阻滞剂之间的分子识别，还没有任何结构信息。
在这里，
研究人员报告了在辅助亚基β2存在下，人源Nav1.2与肽类孔阻滞剂μ-cono毒素KIIIA结合的冷冻电镜结构，分辨率达到3.0 Å。
β2的免疫球蛋白(Ig)结构域通过二硫键与孔隙结构域的肩部相互作用。16-残基KIIIA在重复I至Ⅲ中与胞外段相互作用，将Lys 7置于选择性过滤器的入口。
许多相互作用的残基是Nav1.2特有的，揭示了KIIIA特异性的分子基础。
该结构为NaV通道特定亚型阻滞剂的合理设计建立了一个框架。
原文链接：
http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/13/science.aaw2999
5.人LAT1-4F2hc异聚氨基酸转运蛋白复合物的结构
L型氨基酸转运蛋白1（LAT1;也称为SLC7A5）以钠和pH非依赖性方式催化大的中性氨基酸的跨膜转运。LAT1是氨基酸 - 多胺 - 有机超家族的反向转运蛋白，它还催化甲状腺激素，药物和激素前体如L-3,4-二羟基苯丙氨酸穿过膜的渗透。已经在广泛的肿瘤细胞中观察到LAT1的过表达，因此它是抗癌药物的潜在靶标。
LAT1形成与4F2细胞表面抗原的重链异聚氨基酸转运复合物（4F2hc;也称为SLC3A2）-a II型膜糖蛋白，其用于LAT1的稳定性必不可少的。尽管对LAT1-4F2hc复合物进行了广泛的研究，并对细菌中的同源物进行了结构测定，但LAT1和4F2hc之间的相互作用以及该复合物的工作机制仍然很大程度上未知。
在这里，研究人员报告了人源LAT1-4F2hc的单独及LAT1-4F2hc与抑制剂2-氨基-2-降冰片烷羧酸复合的冷冻电子显微镜结构，其分辨率分别为3.3Å和3.5Å。LAT1表现出向内开放的构象。除了二硫键结合外，LAT1还在细胞外侧，膜内和细胞内侧与4F2hc广泛相互作用。
生化分析表明4F2hc对于复合物的转运活性至关重要。总之，该研究阐明了LAT1-4F2hc复合体的结构，并提供了对其功能及其可能与疾病相关的机制的见解。
参考信息：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1011-z
6.清华大学陈柱成、李雪明及中科院物理所李明解析了不同核苷酸状态下Snf2-核小体复合物的冷冻电镜结构，揭示了染色质重塑的机理
SWI/SNF家族蛋白利用ATP水解产生的能量移动核小体在基因组DNA的位置，重塑染色质。这对于控制遗传物质的开放性，调节基因转录等方面发挥重要作用。陈柱成实验室近期报道了Snf2与核小体结合的结构。
但这个早期的工作并没有明确检测到DNA移位。
染色质重塑蛋白如何利用ATP水解的能量推动核小体滑移依然是一个让人困扰的难题。
这个研究基础上，陈柱成继续与李雪明实验室合作，利用冷冻电镜技术，进一步确定了在不同核苷酸（ADP和ADP-BeFx）状态下Snf2-核小体复合物的高分辨结构（图1）。他们发现在一个ATPase循环过程中，Snf2存在打开-闭合的构象变化。在打开状态下，Snf2在核小体结合点(SHL2)引起1bp DNA的凸起，这个形变沿DNA链向入口端传递，使得 1bp DNA被拉入核小体。而且DNA前导链比后随链有更明显的移动，显示DNA的“扭曲－滑移”运动。
ADP-BeFx的结合导致酶构象闭合，核小体恢复到自然状态，没有明显的扭曲。
Snf2介导的这种DNA运动模式超出一般想象。
为了确认这些实验结果，陈柱成与中科院物理所李明实验室合作，
利用单分子荧光技术(smFRET)确认了溶液状态的DNA运动与冷冻电镜结构一致。
最后，研究者提出了染色质重塑的两步走”DNA波”模型：第一步，ATP水解，Snf2张开，把DNA从入口端拉进，并在SHL2处储存1bp DNA形变（“DNA波”）；第二步，ATP结合，Snf2关闭，使得DNA形变向出口端传递，就像水波沿湖面传递一样,最终实现DNA对组蛋白的相对移动。这个模型表明Snf2水解一个ATP，移动1bp DNA。同时也解释了DNA移动的方向性机制。
总之，本论文解答了染色质重塑过程中DNA移位的基本原理，相信此研究结果在染色质领域会有非常广泛的影响。
参考信息：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1029-2
7.催化活化酵母剪接体的结构揭示了分枝机理
在1977年，Phillip Sharp和Richard Roberts俩个研究组独立发现了剪切这一过程，紧接着，1979年， Steitz研究组发现五种称为U1，U2，U4，U5和U6 snRNA的富含尿苷的小核RNA（snRNA）和7种12-35kDa的蛋白质（snRNPs）。之后， Steitz等研究组发现U1 snRNA的5'末端序列被识别为与5'剪接位点（5'SS）互补，并且snRNP被部分纯化。纯化的U1snRNP在体外特异性结合到5'SS上，并且U1snRNP的消耗抑制了体外剪接。随后，证实了多个snRNPs参与前mRNA剪接。
剪接测定的发展使得剪切反应的描绘成为可能。发现ATP和镁（Mg2 +）对于腺病毒前体mRNA的体外剪接是必不可少的。通过分支点序列（BPS）中的腺苷核苷酸和5'SS的5'末端的鸟嘌呤核苷酸之间的连接形成内含子套索结构，得到了生物化学证实。
前体mRNA剪接是由剪接体催化的，剪接体是一种高度动态和复杂的分子机器，它含有前体mRNA，U1，U2，U4 / U6和U5 snRNPs以及许多非snRNP蛋白。U1和U2 snRNP分别与内含子的5'剪接位点（ss）和分支位点（BS）相互作用，同时为U4 / U6.U5 tri-snRNP的稳定整合铺平了道路，产生了剪接体B复合物。然而，尽管tri-snRNP引入了必需的催化组分，但是剪接体B复合物仍然需要转化成催化活性复合物，这一过程需要广泛的结构重排。通过解开U4 snRNA的U4 / U6双链体（通过RNA解旋酶Brr2）启动活化， U6随后与U2（U2 / U6螺旋Ia和螺旋Ib）以及内部茎环（U6 ISL）自由地形成短双链体。最终在剪接体激活期间建立的催化RNA-RNA网络与II组自我剪接内含子的催化核心非常相似。
随后通过RNA解旋酶PRP2将所得的活化的但是预催化的B（Bact）复合物转化为催化剪接体（命名为B *）。在人类中，B-to-B *转换也需要AQR RNA解旋酶的ATP酶活性，这在酵母酿酒酵母的剪接体中是不存在的。这表明人类剪接体中催化活化所需的构象重排比酵母中的那些更复杂。B *复合物催化剪切的第一步，产生切割的5'外显子和内含子3'外显子套索中间体，产生剪接体C复合物。额外的RNP重排将C复合物转化为C *复合物，然后催化第二步剪接，并且5'和3'外显子的连接形成mRNA并释放内含子作为套索。
2015年，
通过单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析确定剪接体的第一个近原子分辨率结构，报道了来自S. pombe的ILS复合物。从那时起，已经阐明了13种冷冻-EM结构，大部分分辨率在3.3和5.8之间，已经阐明了来自酿酒酵母的组装剪接体的七种不同状态，人类剪接体的7种不同状态的11种这样的结构。
在剪接体的八种已知功能状态中，仅B *复合物在结构上保持未表征。
在这项研究中，
研究人员报告了来自酿酒酵母的B *复合物的冷冻-EM结构。
该研究得到了
酿酒酵母的两种不同前mRNA上组装了B *复合物，并确定了四种不同B *复合物的冷冻EM结构，总分辨率为2.9-3.8Å。
U2核小RNA（snRNA）和分支点序列（BPS）之间的双链离散地远离5个B *复合物中的5'-剪接位点（5'SS），其缺乏步骤I剪接因子Yju2和Cwc25。将Yju2募集到活性位点使U2 / BPS双链体进入5'SS附近，BPS亲核试剂位于距催化金属M24Å处。
该分析揭示了Yju2和Cwc25在分支中的功能机制。不同前mRNA上的这些结构揭示了在主要功能状态下剪接体的底物特异性构象。
这些构象状态的比较揭示了对支化反应的机理见解。
参考信息：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30155-2#
8.与抑制蛋白IF1结合的哺乳动物ATP合酶四聚体的冷电镜结构
通过对结构的分析，阐释了高等哺乳动物ATP合酶的结构组成样式、发挥功能的分子机理、复合物之间协同关系以及对线粒体嵴的形态的影响，为治疗能量代谢疾病、神经退行疾病等，提供了重要的实验依据及结构基础。
在此次发表的论文中，杨茂君教授研究团队首次分离、纯化出哺乳动物ATP合酶四聚体蛋白。由于该四聚体蛋白由多达120个亚基组成，各个亚基排布松散，非常不稳定，如果增加纯化步骤提高纯度会一定程度破坏其完整性；相反，粗提取的蛋白不能满足冷冻电镜样品的要求，目的颗粒所占比例过低，无法收集到足够多的蛋白颗粒用于计算。面对这样的难题，杨茂君教授研究团队通过反复实践，优化实验条件，在两者之间选取了很好的平衡点，既保证了该超大复合物蛋白的完整性，同时又满足了冷冻电镜数据收集的要求。
然而，由于该结构过于巨大，且存在多种构象，在尝试了几乎所有能够利用的计算程序和方法之后，依然无法得到该超大蛋白质机器的高分辨率结构。在对初步计算结果深度分析之后，杨教授敏锐的发现，在该H型的ATP合酶四聚体蛋白中，对角的两个ATP合酶复合物单体具有相似的构象。进而杨教授采用了一种新的计算方法，将四聚体中四个ATP合酶拆分后重新居中，然后单独挖出颗粒，进而将对角构象相似的颗粒合并。这样做不仅极大的缩小了计算中的分子尺度，而且还能提高颗粒数量。在后续的计算中逐步将这两类不同构象的ATP合酶复合物单体的分辨率提高到了原子分辨率水平。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/364/6445/1068
9.哺乳动物电压门控Ca2 +通道配体调控的分子基础
广泛分布的电压门控Ca2 +（Cav）通道参与广泛的生理过程
，例如收缩，分泌和细胞死亡。在哺乳动物中，
10个Cav通道亚型被分为三个亚家族：Cav1（Cav1.1-Cav1.4），Cav2（Cav2.1-Cav2.3）和Cav3（Cav3.1-Cav3.3）。
Cav1通道，也称为L-型Cav或二氢吡啶受体的DHPRs，以包含成孔α1核心亚基和辅助亚基α2δ，β和γ的杂多聚体复合物存在。
Cav通道的α1亚基由约2,000个残基组成，其折叠成四个同源重复序列I-IV。
符合规范电压门控离子通道（VGIC）折叠的每个重复包含六个跨膜区段S1-S6，其构成两个功能实体。每次重复的S1-S4段形成外围电压感应域（VSD）; S5和S6与包括来自四个重复的选择性过滤器（SF）和支持螺旋P1和P2的中间片段一起包围中心离子传导孔结构域。
与其生理重要性相一致，
Cav通道的异常调节或功能障碍与多种神经，心血管，肌肉和精神疾病相关
，如心律失常，偏头痛，癫痫发作，低钾性周期性麻痹，自闭症谱系障碍和帕金森病。因此，Cav通道代表重要的药物靶标。
三种主要类型的L型Ca2 +通道拮抗剂，二氢吡啶（DHP），苯并硫氮杂卓（BTZ）和苯基烷基胺（PAA）已经临床使用数十年 。
其中，DHP化合物在过去的半个世纪中被广泛用于治疗高血压，心绞痛，和早产。作为BTZ和PAA药物的原型，地尔硫卓和维拉帕米均显示血管舒张作用，并已用于治疗心绞痛，高血压，某些心律失常和室上性心动过速。
虽然地尔硫卓和维拉帕米是孔隙阻滞剂，但DHP拮抗剂通过变构作用起作用。更令人感兴趣的是，
一些结构与DHP拮抗剂相似的化合物对L型Cav通道表现出激动作用。
光标记，嵌合筛选和诱变分析为DHP配体的结合和作用模式提供了重要线索。
DHP拮抗剂和激动剂被认为与重复III中由S6III，S6IV和S5和S6之间的接头结合的重叠位点结合。拮抗剂有利于失活状态，而激动剂导致L型Cav通道的延长开放。
尽管如此，精确识别这些化合物的结构基础仍有待阐明。
已经获得了几种DHP拮抗剂和维拉帕米复合的工程细菌同源物CavAb的晶体结构。然而，CavAb上的DHP结合位点几乎不与源自功能表征的DHP结合位点重叠。考虑到同源四聚体CavAb与单链真核Cav通道之间的远距离，与代表性配体结合的L型Cav通道的结构，
对于揭示DHP拮抗剂和激动剂的不同作用模式的分子基础是必需的。
该研究报告了Cav1.1与拮抗药物硝苯地平，地尔硫卓和维拉帕米的复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，分辨率分别为2.9Å，3.0Å和2.7Å；Cav1.1与DHP激动剂Bay K 8644复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，分辨率为2.8Å。
地尔硫卓和维拉帕米穿过孔域的中心腔，直接阻断离子渗透。尽管硝苯地平和Bay K 8644在重复III和IV的界面处占据相同的位点，但协调细节支持以前的功能观察。
这些结构阐明了不同Cav配体的作用模式，并为结构引导的药物发现建立了框架。总之，
结构研究阐明了三种临床应用的拮抗剂和原型激动剂在原子水平上识别和调节L型Cav通道的分子基础，并为大量实验和临床数据提供结构解释。这些结构为未来的药物发现奠定了基础，针对Cav通道病。
参考信息：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30495-7#
10.GPCR-G蛋白复合物形成过程的结构见解
G蛋白偶联受体（GPCR）构成最大的细胞表面受体家族，其感知细胞外信号并激活细胞内途径。
激动剂结合的GPCR与鸟苷二磷酸（GDP）结合的Gαβγ异源三聚体相互作用，导致GDP释放和鸟苷三磷酸（GTP）结合，然后异源三聚体的功能性解离和下游途径的激活。GPCR通常优先激活调节不同细胞信号传导途径的三种主要G蛋白亚家族之一：
腺苷酸环化酶刺激性G蛋白（Gs），Gi / o或Gq / 11。这种耦合偏好的结构基础知之甚少。
β2-肾上腺素能受体（β2AR）-Gs结构是完整GPCR-G蛋白复合物的第一个晶体结构。
到目前为止解决的复杂结构都捕获了无核苷酸状态，其具有结晶学和冷冻电子显微镜所需的稳定性。这些结构揭示了无核苷酸G蛋白与A家族和B族GPCR之间相互作用的显著相似性。在所有这些结构中，
Gα的C末端（α5螺旋）充当受体和核苷酸结合口袋之间的主要构象连接。
几个证据表明在GDP结合的G蛋白和其GPCR之间存在中间状态。
最近的单分子荧光共振能量转移（FRET）研究表明β2AR在细胞溶质浓度的GDP存在下与Gs相互作用。氢 - 氘交换和交联研究也提供了β2AR和GDP结合的Gs之间特定相互作用的证据。这些研究表明，与无核苷酸状态相比，β2AR可能在GDP结合状态下以不同方式与Gα的α5螺旋相互作用。这些研究表明，
在将纯化的β2AR与GsGDP混合的数秒内发生GDP释放，而通过晶体学观察到的稳定的β2AR-Gs复合物的形成需要更长的时间。
在这里，
研究人员呈现β2AR的复合物结构，其中肽代表α5螺旋的C末端14个氨基酸。
该结构揭示了α5螺旋的交替构象，其与活性β2AR的细胞质核结合，其中R389Gα和E392Gα与β2AR的高度保守的DRY基序相互作用。
R389Gα和E392Gα的突变降低了偶联效率，表明观察到的复合物可能代表Gs活化过程中的中间状态。
总而言之，
这些结构为β2AR和Gs之间的交替相互作用提供了证据，
同时提出β2AR的活性结构仅由GsCT的14个氨基酸稳定。该结构可以代表无核苷酸的β2AR-Gs复合物形成中的构象中间体，并揭示G蛋白活化的动态过程。
参考信息：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30440-4
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30441-6#
11/12.配体触发的变构ADP释放引发植物NLR复合物/植物NLR复合物的重构和结构
植物也有一系列防御机制，如抗性基因（R基因）介导的疾病抗性。R蛋白在病原体感染后被激活介导
效应子触发的免疫（ETI）
并导致局部程序性细胞死亡，称为过敏反应（HR）（见下图）。根据结构域组成，R基因至少可被分为五组。其中，含有核苷酸结合位点（NBS）和C末端富含亮氨酸的重复结构域（LRR）的NBS-LRR家族是最大的。
早在2015年，来自中科院遗传发育所的
周俭民课题组
在
Cell Host & Microbe
杂志上发表题为“
The Decoy Substrate of a Pathogen Effector and aPseudokinase Specify Pathogen-Induced ModifiedSelf Recognition and Immunity in Plants”
的研究论文，
该研究
表明激酶PBL2能被来自Xanthomonas 的效应蛋白AvrAC尿甘化后触发免疫。因此，PBL2是充当诱饵并用来检测AvrAC。同时AvrAC的识别还需要ZRK家族的RKS1假激酶和NOD样受体ZAR1。此外，ZAR1与RKS1形成稳定的复合物，当
PBL2
被AvrAC尿苷酰化时，其特异性地被募集，触发ZAR1介导的免疫（如下图）。
然而，上述研究中，仍然具有很多问题需要解决，如
PBL2如何
激活ZAR1-RKS1复合体的机制不太清楚，同时NLR的ADP-和ATP-结合形式分别对应于“关闭”和“开启”状态，但是ADP如何从NLR释放以与ATP交换的机制仍然难以捉摸。此外，植物NLR在活化后如何寡聚化成大蛋白复合物仍然是未知的 。
在第一项研究中，研究者在共同表达了ZAR1与RKS1，并解析了其复合体在ADP结合状态下的冷冻电镜结构。这一代表ZAR1处于“静息状态”的结构表明，RKS1的异二聚体只与ZAR1的富亮氨酸重复（LRR）结构域进行结合，而对这种结合起到关键作用的氨基酸在同一家族中趋于保守。
随后，研究人员们在这个复合体中引入了单尿苷酰修饰（mono-uridylylated）的PBL2，并发现它与RKS1的结合会造成构象的显著变化，将ADP排出ATP结合位点。在没有ATP存在的情况下，这一复合体能处于激活的过渡状态。因此，该研
究
揭示了ZAR1-RKS1识别PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的机制。
在第二项研究中，研究者又往ZAR1-RKS1-PBL2（有单尿苷酰修饰）的复合体中添加了dATP，并获取了冷冻电镜结构。有趣的是，
在dATP的作用下，这一复合体会进一步形成五聚体。
研究人员们发现，这种五聚体的氨基端会微微翘起，形成一个漏斗状的结构。他们猜测，这一结构可能会在细胞膜上制造孔洞，协助ZAR1行使其功能。当然，这一猜想还有待进一步的证实。因此，该研究
证明了植物中的
NLR
在免疫激活过程中
类似动物中的
NLR
进行多聚化。
综上所述，这两项研究成功地组装了ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物(抗病小体)，阐明了抗病蛋白从静息状态经过中间状态最终形成抗病小体的生化过程，揭示了抗病小体的工作机制。抗病小体具有重新调动防御系统的能力，并在植物细胞膜上发出自杀指令，让受到感染的植物细胞与细菌同归于尽，从而保护其它健康细胞。该项工作填补了人们25年来对抗病蛋白认知的空白，为研究其它抗病蛋白提供了范本。研究还发现，植物抗病小体的组装方式、结构与功能，与动物免疫中的炎症小体有着惊人的相似，展现了在不同生命形式中，进化对免疫形成的力量。
原文链接：
Jizong Wang et al., (2019), Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex, Science, DOI: 10.1126/science.aav5868
Jizong Wang et al., (2019), Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity, Science, DOI: 10.1126/science.aav5870
13.颜宁团队同时获取8种冷冻电镜结构，揭示Ryanodine受体调控机制
心肌收缩是由Ca2 +进入细胞质引起的，最初来自细胞外环境，由Cav1.2介导，随后由肌浆网Ca2 +储存，由RyR2介导。
Ryanodine受体是已知最大的离子通道，由分子量大于2兆道尔顿的同源四聚体组成。
超过80％的蛋白质折叠成多结构域，感知与各种调节剂的相互作用，从离子到蛋白质。
RyR2活性的精确调节对于每次心跳都是至关重要的，
RyR2的异常活动与危及生命的心律失常相关。
17kDa的CaM蛋白是一种重要的钙传感器，在大多数钙信号传导事件中起着重要作用。
CaM由大致对称的N-和C-末端叶组成，通过柔性铰链连接。
每个叶可以通过两个EF-手（螺旋E和F-手）基序与两个Ca2 +离子配合，具有微摩尔范围的结合亲和力。
在Ca2 +结合后，两个叶中的几个疏水残基的暴露促进CaM与靶序列的结合。
CaM与ryanodine受体直接相互作用，CaM-RyR的化学计量比为1：
1，在纳摩尔范围的结合亲和力。
然而，
CaM对ryanodine受体的调节是同种型特异性的。
