eBioMedicine（IF 9.7）：单细胞+代谢，北大尹玉新团队揭示不同肿瘤类型的代谢异质性

eBioMedicine 上发表的“Single cell atlas reveals multilayered metabolic heterogeneity across tumour types”通过构建单细胞代谢基因表达图谱，揭示了多种癌症类型的多层代谢异质性，并识别了与化疗耐药性相关的代谢元程序，为个性化癌症治疗提供了新靶点。

方法

数据来源： 从北京大学人民医院收集肿瘤样本进行单细胞转录组、转录组、代谢测序等；从文献和公共数据库获取单细胞转录组数据集和批量转录组数据集；从UCSC Xena和PanCanAtlas获取TCGA数据及其临床信息；从前人研究中获取代谢基因及其通路。

单细胞转录组分析： 使用Cell Ranger处理测序数据并比对人类参考基因组GRCh38，后续使用R包Seurat进行分析（包括从文献中获取的计数数据）；利用inferCNV估计BRCA、CRC、LUAD和PAAD的CNV并用Zhang等人描述的算法识别恶性细胞。

CRC的质谱细胞术数据分析： 使用FlowSOM处理从前人研究中收集的CRC质谱细胞术数据并根据谱系标记物进行细胞注释。

空间转录组分析： 使用Space Ranger软件比对GRCh38基因组以获得样本矩阵和相关H&E图像，并用Loupe Browser进行手动注释，后续利用Seurat进行可视化。

转录组分析： 使用FastQC进行质控，STAR比对参考基因组GRCh38，DESeq2进行差异分析。

代谢组分析： 使用MSDIAL 软件提取原始数据、鉴定峰和质量控制，并用PCA进行降维；MetaboAnalyst用于通路分析。

结果

研究收集并整合了一个涵盖6种癌症类型（BRCA、CRC、LUAD、PAAD、PRAD和STAD）的单细胞转录组数据集（图1b）。通过统一分析，研究识别出12个主要的细胞谱系，其中7个在所有癌种中均存在（图1c）。随后，研究基于从前人研究中获取代谢基因和通路进行SCENIC分析重建代谢调控网络，最终构建了代谢异质性的单细胞转录组图谱。研究还基于代谢基因进行了聚类分析，成功区分了不同的细胞谱系（图1d）。 研究发现恶性细胞的代谢基因表达具有更高的异质性，而非恶性细胞的代谢基因表达具有更高的一致性。此外，同一癌症亚型患者之间的细胞代谢相似性也高于不同亚型之间的细胞。

图1

研究利用Wilcoxon秩和检验进行差异分析，发现75%的代谢基因在至少一个数据集中表现出细胞间表达差异，18%在所有肿瘤中均表现出一致性（图2a）。恶性细胞表现出最高数量的高表达代谢基因，而T细胞和B细胞相对较少（图2b）。 ROGUE分析显示恶性细胞在不同数据集中表现出明显的代谢异质性，而T细胞和B细胞表现出更高的同质性 （图2c）。UQCRQ/PCBD1、GLUL/FTH1等特定的代谢基因在不同细胞类型中表达高水平（图2d，e）。随后，研究利用批量转录组数据和质谱流式细胞数据验证了这些发现。接着，研究确定了不同细胞类型的特异性代谢途径，其中83条是存在显著差异的通路（图2f）。与基因水平结果一致，恶性细胞上调的代谢途径最多。此外，研究重构并识别了每个数据集中细胞类型特异的代谢调节子，如NELFE和SMARCA4、IRF5等（图2g）。

图2

为探究TME不同细胞类型的特异性代谢重编程模式，研究重点比较肿瘤和正常组织中不同细胞的代谢变化。在恶性细胞中，持续上调的代谢基因主要与癌症标志通路相关，如糖酵解和OXPHOS（图3a）。值得注意的是，CA2表达趋势与同家族的CA9相反，后者抑制剂被用于抗癌（图3b）。通路水平结果证实了基因水平的发现（图3c）。此外，肿瘤中几乎所有细胞类型的糖酵解途径和相关基因表达上调，反映了肿瘤微环境整体能量需求的增加。髓系细胞的代谢特征FTH1在不同癌症类型中表达差异明显（图3b）。BRCA和LUAD中许多髓系细胞的代谢途径呈相反调节，暗示这两种癌症中髓系细胞的功能表型可能存在差异。 相关性分析显示细胞水平和个体水平的代谢重编程模式存在差异，混合的伪批次样本与真实批次样本之间的相似性最高，其次是恶性细胞，表明恶性细胞可能主导了肿瘤代谢微环境的形成 （图3d）。

图3

为深入理解肿瘤细胞中的代谢异质性，研究利用NMF算法来识别肿瘤内部的代谢基因表达模式并将其聚类为MMPs。每个MMP可由其TOP30基因总结，这些基因在多个肿瘤内的细胞亚群中协调上调（图4a）。这些MMPs涉及DNA合成、氧化磷酸化、糖酵解、CAC和转运等基本细胞代谢过程。特定的MMPs（如与糖酵解和DNA合成相关的MMPs）与患者总体生存率相关，暗示了它们在肿瘤进展中的潜在作用。虽然MMPs在多个肿瘤中共有，但某些MMPs存在特异性，如MMP9在胰腺导管腺癌（PAAD）和胰腺内上皮性增生（PanIN）病变中显著富集，可能成为PAAD的良性代谢标志物（图4b-d）。进一步的药 物敏感性分析表明，MMP7高表达的结直肠癌细胞系与elesclomol耐药性相关，OXPHOS（MMP3和MMP12）和CAC（MMP5）较高的肺癌细胞系对elesclomol更敏感 （图4f-g）。

图4

鉴于恶性细胞MMPs与临床紧密关联，研究试图探索这些MMPs的调控机制。通过检查每个肿瘤内调节子评分和MMP评分之间的相关性研究，研究确定了不同癌症中高度重复的主要调节因子。随后，研究评估了这些调节因子的表达与总体生存率的关联，并发现FOSL1和MYBL2在多种癌症类型中与较差的生存率相关（图5a）。研究通过体外实验证实FOSL1可能是MMP4（糖酵解）、MMP6（转运）、MMP10（氨基酸代谢）和MMP11的潜在调节子。FOSL1敲低后，糖酵解基因和转运蛋白的表达显著降低（图5b，c）。GSEA分析进一步支持了这些MMPs的失调（图5d）。此外，非靶向代谢组分析显示，FOSL1敲低后会影响多种氨基酸的代谢（图5e，f）。

图5

研究将重点转移至非恶性细胞上，并定义了TME内各种常见细胞类型中的MMPs（图6a）。非恶性细胞的MMPs与恶性细胞的相似性有限，但几个DNA合成和OXPHOS相关MMPs除外。大部分非恶性MMPs在不同癌症类型中是相同的，表明这些细胞代谢异质性是固有的。非恶性MMPs与免疫细胞分化的关联分析显示，不同程度的T细胞耗竭与代谢模式的逐渐转变相关（图6b）。CD8+T细胞的不同亚群与氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸代谢相关的MMPs呈渐进性关联。类似地，CD4+T细胞的亚群与代谢基因、免疫抑制性相关的MMPs呈现显著关联。巨噬细胞的M1/M2极化状态与不同代谢过程之间的相关性不同。此外，通过共表达网络分析，研究揭示了 肿瘤细胞与非恶性细胞之间在代谢层面的相互作用和潜在的代谢依赖关系 （图6c）。

图6

为挖掘细胞水平代谢异质性的临床意义，研究将来自同一癌症细胞类型的单个细胞基因表达数据聚合，构建了细胞类型特异性的伪批量样品。随后，研究利用GSVA对这些样品进行了代谢通路评分，并基于此评分聚类得到5个模块。研究利用这5个模块再对样本进行聚类，以获得相似代谢特征的样本簇。此外，研究通过检查每个细胞类型的样品细化了聚类结果。对于恶性特异性样品，C1涵盖了大多数BRCA和LUAD样本，而来自其他肿瘤的样本构成了C2。不同癌症类型的非恶性特异性样品混合在一起，其中某些癌症类型表现出明显偏好（图7a，b）。研究进一步鉴定了与这些代谢类型相关的基因标记，并将其应用于肿瘤患者的分组。有趣的是， 具有更高髓系和内皮C2特征评分的肿瘤在多种癌症类型中表现出更差的总体生存率 （图7c-f）。

图7

结论