精品论文|如何利用分子实验验证GWAS发现的SNP？

2017/8/28

MONDAY

解释遗传关联分析结果的生物功能一直是一个很大的挑战，而这里要分享的文章则是一个成功的案例。通过 GWAS 发现的 SNP rs965513 作为 risk allele 对甲状腺癌易感性的机制。这篇文章的研究思路可以帮助我们思考遗传变异位点的潜在生物学机制。位于 enhancer 或者是非编码 RNA 中的变异可能很大程度上导致复杂疾病的遗传易感性。

乳头状甲状腺癌（ papillary thyroid carcinoma, PTC ）是最常见的甲状腺癌症。关联分析指出该疾病很大程度上受到遗传因素的影响。 GWAS 研究已经发现在 9q22 区域的单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism, SNP ） rs965513( 非编码 ) 与 PTC 有关（ odds ratio~1.8 ） , 并且在不同人群中的到了独立重复验证。 SNP （ rs965513 ）位于 forkhead box E1 ( FOXE1 ) 上游的 ~60 kb 。 FOXE1 是一种已知的甲状腺转录因子，对甲状腺的功能，发育和分化至关重要，并且多次被报道与 PTC 的癌症发生有关。另一个功能性 SNP （ rs1867277 ）位于 FOXE1 启动子区域，也被报道与 FOXE1 转录调控有关。

最近，这个研究团队发现了一个甲状腺特异性的基因间长非编码 RNA 基因（ PTC susceptibility candidate 2 ( PTCSC2 ) 。在人类基因组中，该基因位于 FOXE1 的反义链上： PTCSC2 的 transcript isoform c 中的 exon 1 和 intron 1 与 FOXE1 启动子区域重叠，这说明 PTCSC2 和 FOXE1 可能共享同一个启动子或者转录调节机制。在甲状腺组织中， PTCSC2 有剪切和未剪切两种转录本：剪切转录本有 11 个 exons 和一些不同的剪切亚型，而 SNP rs965513 正好位于未剪切转录本上（或者剪切的 intron 上）。另外，在 PTC 病人的正常甲状腺肿瘤， rs965513 的有害基因型 [AA] 与 FOXE1 , PTCSC2 , 和 TSHR 的表达降低显著相关。尽管，这些发现指出了 FOXE1

和 PTCSC2 与 PTC 的易感性和肿瘤发生的联系，但是 SNP rs965513 所产生效应的分子机制还是没有得到解释。

细胞中基因表达是受到 DNA 调节元件和序列特异性转录因子，以及染色质修饰的影响。因此，该团队推测在 rs965513 周围（ 9q22 ）存在 FOXE1 和 PTCSC2 转录的调节元件。于是，他们对 9q22 位点进行仔细分析和寻找导致 PTC 的功能性变异。最终， 他们根据研究结果暂时得出 9q22 诱发 PTC 是通过多种机制，而这些机制涉及到增强子， TF （ transcript factor ）结合位点，和两个及以上基因的转录变化。

接下来具体介绍该团队的研究过程：

重测序， SNP 基因分型和 Imputation ，和 Haplotype 分析

为了更好的找出 9q22 位点上的功能性 SNPs 和 PTC 相关的变异，该团队对 22 个 PTC 病人的染色体 9 号： 100455000–100622000 （ 167 kb ）区域进行深度测序并进行 LD 分析。分析结果显示，在 PTC 病人和千人基因组计划 EUR 个体中， GWAS SNP 周围都存在一个 33 kb 的 LD block （图一）。

接着，为了在这 33 kb 区域中找出与 PTC 独立关联的 SNPs ，该团队在 1146 cases 和 1328 controls 中，进行 imputation 和 haplotype 分析。他们发现 33 kb 中， 只有 3 个 haplotypes （ Hap1: OR=1.79 ， Hap2: OR=1.24 ， Hap3: OR=1.54 ）包含 rs965513 的有害 allele[A]. 另外，对 Hap1 的 diplotype 分析发现：杂合 Hap1 携带者的显示 OR=1.695 ，而纯合显示 OR=3.423 。

总之，这些统计分析结果使他们把研究重点放到 ~33kb 区域。

在甲状腺癌细胞系 KTC-1 和未感染甲状腺组织中， 9q22 富集了增强子组蛋白标记

考虑到 GWAS SNP 在 FOXE1 和 PTCSC2 中的位置，他们猜测 33kb 中的功能性 SNPs 是调节了重要的顺式转录调节元件，然后，利用公共数据库进行预测（ transcription factor (TRANSFAC) database ， Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) ChIP sequencing data ， 和 HaploReg annotated information ）， 他们发现有些区域包含了多个 TF 的结合位点（图二）。因此，他们选择了包含候选 SNPs 的 3 个区域，并根据它们的远程调控作用设计为 enhancer 1 ， enhancer 2 ，和 enhancer 3 。

接着，该团队就集中研究这三个 enhancers 。由于组蛋白是活跃型增强子标记，他们，在 KTC-1 细胞系和未感染的甲状腺组织中，对 H3K4me1 和 H3K27Ac 做了 ChIp 实验，并发现这两种组蛋白显著富集在 enhancer 1 ， enhancer 2a ， enhancer 2b ，和 enhancer 3 （图三）。这一结果为 9q22 位点存在多种 vivo enhancers 提供了独立证据。

3 个 enhancers 元件中增强子活性受到 SNP allele 的影响 。

为了研究这 3 个 enhancers 的功能是不是受到 SNP allele 的影响，该团队进行了荧光素酶检测实验。他们对这 3 个 enhancers 的 risk allele 片段和 WT allele 片段分别进行扩增，并连接到荧光素酶报告载体上，然后，在 KTC-1 细胞系中进行检测。根据观察结果显示， enhancer 2 中 rs12352658 的 [G] allele 和 rs7847449 的 [C] allele ，和 enhancer 3 中 rs10759944 的 [A] allele 都显示与 WT 相比显著增强荧光素酶的活性（图四）。由于 enhancer 1 没有观察到显著结果，于是，他们在做 enhancer 1 的荧光素酶实验时，同时转染了表达 CEBPa 或者 CEBPb 的质粒。结果，他们观察到，在出现 CEBPa 或者 CEBPb 时， enhancer 1 中 rs7864322 的 risk allele [C] 显著降低荧光素酶的活性。

这部分实验结果指出， 在 9q22 位点中至少存在 3 个增强子元件并且它们的功能受到 allele 影响。总而言之这部分数据说明 GWAS SNP 附近有多种 allele 特异性的远程增强子元件（ long-range enhancer element ）。

针对 TFs 进行 ChIp 实验

为了进一步证明 3 个 enhancer 元件中的 SNPs 的功能，该团队利用 ChIp 实验技术，检测之前预测的 TFs 能否结合到 enhancers 上，和这种作用是否受到 allele 特异性的影响。于是，他们首先在 KTC-1 细胞系中检测

首先，他们在 KTC-1 细胞系中检测一系列预测发现的 TFs ，包括 CEBPa, CEBPb,STAT1, YY1, cJUN, ER, 和 TFAP2A 。 他们发现 CEBPa, CEBPb, 和 TFAP2A 有显著的结合作用。在正常的甲状腺组织中， CEBPb 显著结合到 enhancer 1 上，但是没有结合到 enhancer 3 上（图五）。 TFAP2A 则显著结合到 enhancer 2a 和 3 上（图五）。接着，他们研究这些 TFs 与 enhancers 的相互作用是不是具有 allele 的特异性。在这里，他们用 SNaPshot 实验对 3