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在《Cell》期刊发表的这篇文章中，来自山东大学、北京大学、南京大学和德国莱比锡大学的研究团队揭示了GPR133作为膜受体在感知雄激素5α-二氢睾酮（5α-DHT）中的作用。研究发现，5α-DHT通过激活GPR133受体，能够提高肌肉强度，并增加细胞内的环磷酸腺苷（cAMP）水平。通过冷冻电子显微镜结构分析，研究者们揭示了5α-DHT与GPR133的结合模式，发现了两个关键的粘附GPCRs（aGPCRs）结构域在类固醇识别中的重要性。此外，研究团队通过计算机筛选方法设计了一种小分子AP503，它能够激活GPR133，同时减少雄激素在前列腺的副作用。GPR133作为一种雄激素膜受体，不仅在正常雄激素生理中起到重要作用，还具有潜在的治疗应用价值。
5α-二氢睾酮（5α-DHT）是雄激素中最强效的激素，在男性青春期骨骼和肌肉功能以及第二性征的发育中起着至关重要的作用。5α-DHT通过增加骨密度和促进骨骼肌生长来增强肌肉力量。此外，5α-DHT在调节能量代谢和认知效应等生理过程中也发挥着重要作用。雄激素主要通过与核雄激素受体（AR）结合来发挥作用。除了通过直接激活AR来调节基因转录外，5α-DHT还可以在几秒到几分钟内引发急性生物反应，例如调节肌肉力量和诱导巨噬细胞中的Ca2+信号。值得注意的是，5α-DHT可以在雄性大鼠生长板软骨细胞中诱导蛋白激酶C（PKC）和磷脂酶A2（PLA2）的快速激活。这些效应对AR或转录抑制剂不敏感，但受到G蛋白抑制剂的影响，提示5α-DHT可能与G蛋白偶联受体（GPCRs）相互作用。然而，5α-DHT与GPCRs结合的直接证据仍然缺乏。
本研究确定了5α-DHT可以激活GPR133并有助于增加肌肉力量。通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析了GPR133-Gs复合物与5α-DHT或甲氢龙（MET）的结合结构，揭示了这两种类固醇激素与GPR133的结合模式。我们进一步鉴定了AP503作为合成的GPR133激动剂，它能够在减少雄激素在前列腺的副作用的同时增加肌肉力量。研究表明，GPR133是5α-DHT的候选膜受体，能够调节肌肉力量。通过分析小鼠肌肉组织的RNA测序数据，筛选出30种高表达的GPCRs，最终确定GPR133对5α-DHT具有显著反应。GPR133在野生型成年小鼠的快肌纤维膜组分中表达，而在Gpr133−/−小鼠中未观察到这种表达。行为实验结果表明，5α-DHT注射30分钟后肌肉力量显著增强，但在Gpr133−/−小鼠中这种效应被抑制。这些结果表明，GPR133是5α-DHT的候选膜受体，能够调节肌肉力量。
研究揭示了5α-二氢睾酮（5α-DHT）作为一种雄激素，通过激活肌肉细胞中的膜受体GPR133来增强肌肉力量。通过冷冻电子显微镜结构分析，研究团队发现5α-DHT与GPR133结合后，能够增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的水平，从而促进肌肉收缩力的增强。此外，研究还发现GPR133中存在的两个关键结构域“Φ(F/L)2.64-F3.40-W6.53”和“F7.42××N/D7.46”在类粘附G蛋白偶联受体（aGPCRs）中普遍存在，这些结构域对甾体激素的识别至关重要。研究通过计算机筛选方法设计了一种特异性激动剂AP503，该激动剂能够激活GPR133并在增强肌肉力量的同时减少雄激素相关的副作用。AP503通过激活GPR133-Gs-cAMP通路来增强肌肉力量，而不会引发与雄激素受体（AR）相关的副作用，如前列腺增生等。这一发现表明GPR133不仅是5α-DHT的膜受体，还具有重要的治疗潜力，尤其是在需要增强肌肉力量而避免雄激素副作用的情况下。
GPR133的鉴定和作用：研究识别了GPR133是5α-DHT在肌肉中的膜受体，并证实其激活可以显著增加肌肉力量。这意味着，通过针对GPR133，可开发出新型的治疗策略以增强肌肉功能，特别是在老人或肌肉功能受损的患者中。新型激动剂AP503的设计：研究通过计算机筛选设计了一种特异性激活GPR133的小分子激动剂AP503。该化合物能够在不引起传统雄激素受体（AR）介导的副作用（如前列腺增生等）的情况下增强肌肉力量，这为雄激素相关副作用的缓解提供了可能性。结构生物学的贡献：通过冷冻电镜解析了GPR133与5α-DHT及其衍生物之间的结合模式，揭示了不同结合位点的结构基础。这不仅有助于理解GPR133的激活机制，还为新药设计提供了精准的结构信息。信号通路的完善：研究进一步表明，GPR133的激活通过Gs-cAMP-PKA通路促进肌肉收缩，这一发现为肌肉增强的分子机制提供了新的视角，也为相关药物开发提供了机制基础。总的来说，这项研究不仅在基础科学层面上揭示了雄激素作用的新机制，还在临床应用方面展示了通过GPR133来实现肌肉增强的潜力，具有显著的临床意义和应用前景。
1. 受体识别与功能验证：通过分析小鼠肌肉组织的RNA测序数据，筛选出可能与5α-DHT结合的G蛋白偶联受体（GPCR），最终确定GPR133是主要响应受体。使用体内和体外实验验证GPR133在5α-DHT刺激下的功能，证明其能增加环磷酸腺苷（cAMP）水平和肌肉收缩力。
2. 结构分析：应用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术解析GPR133与5α-DHT及其衍生物的结合结构，揭示了两种结合模式：水平（5α-DHTH）和垂直（5α-DHTV），分别对应低和高亲和力状态。确定了GPR133结合5α-DHT的关键结构域和氨基酸位点，为后续激动剂设计提供结构基础。
3. 激动剂设计与筛选：通过计算机虚拟筛选，利用GPR133的结构信息，筛选出不与雄激素受体（AR）结合的特异性小分子激动剂AP503。进一步通过功能实验验证AP503的选择性和效力，确认其能够在不引发AR介导的副作用的情况下增强肌肉力量。
4. 体内效应评估：在小鼠模型中测试AP503对肌肉力量的影响及其可能的副作用，结果显示AP503能够显著增强肌肉力量，同时减少雄激素相关的副作用。
数据解读
图1：GPR133作为肌肉中5α-DHT的膜受体的鉴定
图1旨在鉴定5α-DHT在肌肉中的膜受体，研究GPR133在此过程中的作用。A. 研究流程图展示了识别5α-DHT膜受体的研究步骤。B-C. 通过测量不同年龄（4、8和12周）雄性和雌性小鼠血清（B）和EDL组织（C）中内源性5α-DHT的浓度，发现5α-DHT在不同性别和年龄的小鼠中存在差异。D. 通过测量从8周龄雄性小鼠中分离的EDL的强直收缩力，研究了不同浓度的5α-DHT在有无ORM-15341（5 μM）存在下的作用。结果表明，5α-DHT处理组的最大等长力（Po）显著高于对照组，而ORM-15341的加入则无显著影响。E. 通过检测8周龄野生型小鼠EDL中的cAMP水平，研究了不同浓度5α-DHT在有无ORM-15341（5 μM）存在下的作用。结果显示，5α-DHT处理组的cAMP水平显著高于对照组，而ORM-15341的加入无显著影响。F. 热图展示了在HEK293细胞中转染不同GPCR后，5α-DHT（100 μM）诱导的cAMP水平变化，表明GPR133可能是5α-DHT的膜受体。G. 示意图展示了Gpr133GFP小鼠系的生成过程，其中GPR133的N端和C端分别标记了3×FLAG标签和GFP序列。H. 在Gpr133GFP或野生型小鼠的EDL组织中，观察到GPR133（绿色）与MYH4（红色）的共定位，支持GPR133在肌肉中的表达。I. 在悬挂实验中，定量分析了8周龄野生型或Gpr133−/−小鼠在处理了对照或5α-DHT（2 mg/kg，肌肉注射）30分钟后的掉落潜伏期。结果显示，5α-DHT处理的野生型小鼠表现出显著的增强，而Gpr133−/−小鼠则无此效应。J. 在握力测试中，定量分析了8周龄野生型和Gpr133−/−小鼠在处理了对照或5α-DHT（2 mg/kg）30分钟后的握力。结果表明，5α-DHT处理的野生型小鼠握力显著增强，而Gpr133−/−小鼠无此效应。结论：GPR133被鉴定为5α-DHT在肌肉中的膜受体，其在增强肌肉力量和cAMP水平中发挥重要作用。
图2：5α-DHT通过激活GPR133-Gs通路增加肌肉力量
图2展示了5α-DHT如何通过激活GPR133-Gs通路来增强肌肉力量。以下是对图2的解读：Gs通路激活：图中展示了5α-DHT如何与GPR133结合，以激活Gs蛋白的信号通路。通过使用不同的实验方法（如Gs蛋白解离的BRET分析），研究人员确定了5α-DHT对Gs通路的有效激活浓度（EC50）。实验设计：实验通过在HEK293细胞中过表达GPR133来研究5α-DHT的作用，并测量了5α-DHT对cAMP积累的影响，这是Gs通路激活的标志性特征。AP503验证：该图还包括了对合成激动剂AP503的分析，验证了AP503在不显著激活其他通路的情况下有效激活Gs。抑制实验：通过实验预处理Gs抑制剂NF449，研究进一步确认了5α-DHT的作用是通过这个具体的Gs通路进行的，而不是通过其他潜在路径。总的来说，Figure 2直观展示了5α-DHT及其合成类似物AP503是如何特异性地通过GPR133-Gs通路介导信号传导从而增强肌肉力量的。研究强调了Gs通路在这一过程中至关重要的作用，并为开发新型肌肉增强剂提供了靶点。
图3：5α-DHT-GPR133-Gs和MET-GPR133-Gs复合物的整体结构
图3展示了5α-DHT-GPR133-Gs和MET-GPR133-Gs复合物的整体结构。以下是对图3的解读：冷冻电镜结构：图中使用了冷冻电镜技术（cryo-EM）解析了不同配体（5α-DHT和MET）与GPR133-Gs复合物的结合结构。这些结构揭示了5α-DHT和MET在GPR133中的具体结合模式。5α-DHT结合模式：研究发现5α-DHT在GPR133中有两种不同的结合位置：水平和垂直。图中详细展示了这些结合模式如何影响GPR133的激活状态。两种结合模式在GPR133-GAIN-Gs复合物中获得了高分辨率的结构，进一步帮助理解调控机制。MET结合模式：类似于5α-DHT，MET在GPR133中的结合也被详细描述。尽管MET和5α-DHT的结构略有不同，但它们在受体内的结合位点有相似之处，提供了对配体和受体相互作用的理解。结构比较：图中还展示了5α-DHT和MET在结合口袋中与不同氨基酸残基的相互作用，以及这些相互作用如何影响GPR133的构象变化。特别是，结合口袋的大小和形状对配体的选择性具有重要意义。功能影响：这些结构数据提供了关于配体如何通过特定的结合模式影响受体功能的分子基础。这对于识别GPR133作为潜在治疗靶点具有重要意义。通过Figure 3的展示，研究提供了关于类固醇激素如何通过膜受体GPR133进行识别和信号传导的详细分子机制。这些结果为进一步开发针对GPR133的选择性药物奠定了基础。
图4：5α-DHT和MET在GPR133中的结合模式
图4详细解析了5α-DHT和MET在GPR133中的具体结合模式，为理解这些配体如何与受体相互作用提供了分子基础。5α-DHT的垂直结合模式：5α-DHT在GPR133中的垂直结合模式被详细展示。其结合口袋由多条跨膜螺旋TM1-TM3、TM5-TM7和第二胞外环（ECL2）围绕。在这一模式中，5α-DHT的3-羰基与残基N7957.46形成极性接触，而17-羟基则与Q5631.36发生相互作用。这些极性网络的破坏（通过突变）显著降低5α-DHT诱导的GPR133-FL活性。水平结合模式：除了垂直模式外，5α-DHT还有一个水平的结合模式。两种结合模式的存在表明5α-DHT可以在结合口袋中以不同的构象方式存在，从而可能影响结合亲和力和受体活性。MET结合模式：MET的结合模式类似于5α-DHT的水平模式，但其独特的双键结构使其与关键残基形成了强的π-π相互作用。这些相互作用对于MET的结合稳定性和受体活性非常重要。关键结合残基：图中展示了一些关键结合残基，如Q563、L619、F623、F643和W773，它们在不同物种的GPR133中是保守的，但在其它aGPCR成员中并不保守。这些残基在GPR133对5α-DHT和MET的选择性识别中起着重要作用。结合模式的功能影响：图中对比了不同结合模式下的残基相互作用，帮助识别影响受体激活的关键结构因素。这为理解配体的结构差异如何带来不同的生物学活性提供了依据，也是未来设计高选择性GPR133激动剂的重要参考。总体来说，Figure 4提供了对类固醇配体如何通过不同结合模式与GPR133相互作用的分子机制的详细见解，有助于药物设计过程中对受体-配体相互作用的精细调控。
图5探讨了在几种aGPCR中用于识别类固醇激素的共同模体，揭示了这些受体如何用于类固醇的特异性识别和结合。共同模体的结构特征：图中展示了几种aGPCR中的Φ(F/L)2.64-F3.40-W6.53和F7.42××N/D7.46模体，它们在识别类固醇激素中的保守性。这些模体位于受体结合口袋中，通过形成专一的疏水和极性相互作用来识别类固醇骨架。疏水核心识别：研究指出，Φ(F/L)2.64-F3.40-W6.53模体中的W6.53位置是识别类固醇四环骨架的关键，通常通过形成直接相互作用来感知类固醇的结合。极性相互作用识别：此外，F7.42××N/D7.46模体中的残基通过与类固醇的羟基和羰基形成极性相互作用，帮助锁定配体。这些相互作用增强了类固醇与受体之间的结合力。aGPCRs的类固醇识别能力：通过比较和分析，这些模体在受试的aGPCR（如GPR97、GPR64、GPR126）中表现出高度保守，表明许多aGPCR可能具有识别类固醇激素的能力。这意味着潜在超过70%的aGPCR可以用来识别类固醇激素或其衍生物。功能验证：图中通过功能性实验验证了这些模体中的关键残基的功能重要性。突变分析显示，对这些保守残基进行突变会显著削弱GPR64、GPR126或GPR133受体对其相应类固醇激动剂的响应。总体而言，Figure 5揭示了aGPCR家族中多个成员之间广泛共享的模体对于类固醇激素识别的关键作用。这些发现有助于理解aGPCR如何以类似和保守的方式与类固醇激素作用，为未来开发更多类固醇激素靶向疗法提供了结构基础。
图6：AP503对GPR133的选择性及其结构基础的鉴定
图6解释了如何通过结构基础识别和设计选择性GPR133激动剂AP503的方法，并揭示其选择性的分子机制。虚拟筛选策略：研究采用了一种结合正向和反向虚拟筛选的方法来发现选择性GPR133激动剂。通过分析5α-DHT在GPR133和雄激素受体（AR）中的结合口袋，研究识别了特定的残基，这些残基与5α-DHT在GPR133的选择性结合有关。在虚拟筛选中，对百万级化合物进行筛选，排除了可能与AR结合的化合物。AP503的发现：通过虚拟筛选和类比化合物测试，最终发现了AP503这一有前景的GPR133激动剂。AP503能够选择性激活GPR133的Gs信号通路，而对AR及其他aGPCR没有明显活性。AP503的结构基础：AP503的结构分析展示了其与GPR133的结合模式。AP503的结合口袋展示了比5α-DHT更大的Y型结构，由三个子口袋组成，便于特定段的结合。AP503的每个部分通过与GPR133口袋中不同残基的特异性相互作用来增强其选择性。选择性关键残基：图中展示了一些在AP503结合过程中起到关键作用的残基，这些残基的位置在aGPCR家族中不够保守，突变这些残基明显削弱了AP503对GPR133的活性。这样的不一致性解释了AP503对GPR133的高选择性。结合模式验证：通过突变分析，验证了AP503与GPR133结合的关键残基的功能。结果表明，AP503能显著激活GPR133但对AR没有作用，大大减少了雄激素相关的副作用。Figure 6强调了利用结构生物学和虚拟筛选相结合的方法所带来的药物发现新策略，展示了AP503作为GPR133高选择性激动剂在增强肌肉力量同时减轻雄激素副作用的潜力。这为设计更多选择性和有效的GPCR药物提供了宝贵的经验和理论基础。
