骨关节炎(OA)的特征是进行性软骨退化和慢性关节痛，是全球面临的重大健康挑战。虽然关节内给药是一种常见的治疗方法，但其疗效受限于药物在致密软骨基质中的渗透性较差，尤其是疏水性化合物。近日，
青岛大学附属医院的张海宁团队
介绍了一种新型电荷引导的微/纳米载体系统，通过用缩水甘油基三甲基氯化铵(GTAC)改性直链淀粉制备带正电的载体，疏水性Piezo1抑制剂Margaric酸(MA)通过DMSO超声处理有效地封装在改性直链淀粉的螺旋腔内，形成阳离子直链淀粉微/纳米载体@MA(CAMNC@MA)（方案1）。该系统有效地将MA输送到软骨细胞精确调节与OA发展有关的关键机械传感器Piezo1
。
研究表明，CAMNC@MA成功抑制了软骨细胞中异常机械力诱导的Piezo1激活，提高了细胞存活率，减少了基质降解，并有效缓解了OA进展。这种创新的药物递送平台通过将增强的基质渗透与疏水性治疗剂的有效基质渗透相结合，为临床OA治疗提供了一种有前途的策略。
相关研究成果以
“Charge-Guided Cartilage-Penetrating Micro/Nanocarriers That Inhibit Piezo1 and Protect Cartilage to Alleviate Osteoarthritis”
为题于2024年1月30日发表在
《Advanced Functional Materials》
上。
方案1 CAMNC@MA的设计、合成和应用示意图
1.用于疏水性药物软骨渗透输送的微/纳米载体的合成与表征
SEM成像显示CAMC@MA为不规则球体，直径约为10 μm（图1Ci，红色箭头），而TEM显示CANC@MA为不规则颗粒，宽度约为50 nm（图1Cii，绿色箭头）。CAMNC@MA在SEM分析中展示了两种成分的特征（图1Ciii）。Zeta电位分析表明，未改性的直链淀粉纳米粒子带有≈-20 mV的负电荷，而CAMA@MA和CANC@MA都带有≈+45 mV的强正表面电荷（图1D）。这种显著的电荷反转证实了GTAC介导的载体阳离子化成功，因为它能够与带负电荷的软骨基质发生有效的静电相互作用。DLS测量的尺寸比TEM和SEM图像中观察到的尺寸更大（图1E、F），这可能是由于颗粒在水溶液中膨胀所致。溶胀率表明，冷冻干燥的CAMC@MA具有较高的吸水能力，有利于CANC@MA的释放（图1G）。
傅里叶变换红外(FTIR)光谱表明直链淀粉已成功进行阳离子改性（图1H）。X射线衍射(XRD)分析表明，CAMNC@MA呈现出特征性的V型晶体结构，证实MA已成功封装在CAMNC的疏水螺旋腔内（图1I）。使用尼罗红作为荧光探针进一步验证了封装能力，在荧光显微镜下，当与CAMNC (CAMNC@Nile-Red)复合时，会发出明亮的红色荧光，表明疏水微环境的形成（图1J）。定量分析表明，1 mg CAMNC可以包封约120 μg MA，略微超过未改性直链淀粉的容量，这可能是由于CAMNC的正电荷介导的MA 吸附（图1K）。
图1 CAMNC@MA的表征和疏水药物负载特性
2.药物释放行为及生物相容性
作者使用游离脂肪酸测定试剂盒对CAMNC@MA 的体外药物释放动力学进行量化。CAMNC@MA复合物在前5天内表现出快速的MA释放，然后过渡到稳定状态，释放持续约18天（图1L）。在SD大鼠关节内注射后，使用Dir标记的载体评估CAMNC的体内保留和分布。使用PerkinElmer系统对股骨滑车进行荧光成像显示第1天关节表面有强信号，可检测到的荧光在股骨髁上持续到第10天，然后在第14天完全消失（图1M、N）。这些结果证明了CAMNC对疏水化合物的持续保留和控制释放能力。
通过全面的体外和体内研究，系统地评估了CAMNC@MA的生物相容性。对于体外评估，使用多种互补方法检查了细胞毒性。CCK-8测定表明，在适合的CAMNC@MA浓度下软骨细胞活力保持在90%以上（图2D），活/死细胞染色进一步证实了这些发现（图2E、F）。溶血率结果表明CAMNC@MA具有良好的血液相容性（图2G）。
图2 CAMNC@MA的软骨黏附与穿透及其生物相容性评价
3.机械刺激对软骨细胞活力的影响
为了模拟软骨细胞受到的病理性机械应力，作者开发了聚二甲基硅氧烷(PDMS)拉伸室系统。虽然之前的研究表明20%拉伸损伤会在小胶质细胞中诱发反应性表型，假设软骨细胞可能因其独特的生理特性而表现出不同的机械反应。因此，作者系统地评估了2小时内软骨细胞对不同拉伸强度（20%、40%、60% 和80%）的反应（图3A）。拉伸后24小时进行的乳酸脱氢酶(LDH)释放试验显示，培养基LDH含量随应变增加，在拉伸40%时显著升高。在拉伸60%和80%时，LDH水平接近细胞完全裂解时观察到的水平（图3B）。拉伸后立即进行的形态学分析显示，随着应变强度的增加，软骨细胞形状逐渐从多边形变为纺锤形。值得注意的是，膜破裂在拉伸40%时变得明显，在拉伸60%和80%时几乎普遍存在（图3C）。用碘化丙啶(PI)染色的荧光显微镜证实了这些观察结果，显示细胞死亡显著增加（红色染色），在拉伸40%时趋于稳定（图3D）。
根据上述结果选择40%拉伸作为后续实验的最佳条件，因为它产生可重现的细胞损伤。
