韩春雨已向Addgene提交详细实验计划书，有中国学者称已成功重复实验结果

生物学家韩春雨每天都会接到很多骚扰电话短信，但他对自己的技术依旧信心十足。图片来源：韩春雨

韩春雨的NgAgo基因编辑技术能否成为除了CRISPR–Cas9之外的另一个选择，应该是目前生物领域最具争议的热点事件了。

三个月前，来自河北科技大学的生物学家韩春雨发表了关于NgAgo可以用来编辑哺乳动物基因的论文。目前，已经有越来越多的科学家表示无法重复韩春雨的实验结果。但的确也有人告诉《Nature》，他已经重复出了韩春雨的实验研究，后文会提到。

韩春雨表示，现在他每天都会接到几十个骚扰电话和短信，对他各种讽刺嘲笑，甚至说“你的事业已经毁了”。但韩春雨对自己的技术充满信心，他日前向《Nature》表示，自己已于8月8日向在线基因信息资料库Addgene提交了详细的实验计划书，并希望此举能够帮助研究者们重复他的实验结果。此外，刊登韩春雨研究成果的《Nature Biotechnology》目前也宣布将对事件进行调查。

过去几年，CRISPR-Cas9为生物学带来了变革。但这也使科学家们如饥似渴地寻找其他编辑方法来进一步完善基因编辑工具库，而NgAgo就是诸多尝试中的一例。“我们很多人都支持这一新的基因编辑方法，也希望它的确是有效的，”哈佛大学医学院著名基因科学家乔治·彻奇（George Church）表示。

CRISPR–Cas9通过小型基因序列来引导酶，对DNA进行定位剪辑。韩春雨受此启发，开始寻找其他可引导的蛋白“剪刀”，最终发现Argonaute（或称Ago）蛋白家族可以满足要求。此前，也有其他人提出这种蛋白有可能被用于基因编辑。

在论文中，韩春雨的团队称使用了多种不同基因序列对NgAgo蛋白进行引导，实现了对8种人体细胞基因的编辑，并在染色体特定点位上插入了基因。

根据韩春雨的介绍，最关键的是NgAgo只会定向切除目标基因，而CRISPR–Cas9有时会编辑错误的基因。此外，CRISPR–Cas9要求剪切点附近存在某种特定的基因序列，以激活编辑，而NgAgo则没有这种要求，这将使该技术获得更广泛的应用。

韩春雨的研究成果最初在中国国内引发了巨大的关注和赞扬，中央电视台都亲赴其实验室进行实地采访。韩春雨认为当时都有点喘不过气了，毕竟，他习惯了低调，他的业余爱好也都是诸如收藏茶叶、弹奏古琴这类修身养性之事。他从不喜欢旅行，也没离开过中国。今年3月去杭州拜访一位合作伙伴，居然是42岁的韩春雨第一次坐飞机。在论文发表之前，“我完全是无名之辈”，韩春雨对《Nature》说道。

最早对韩春雨研究成果的质疑出现在7月初，有生物化学专业背景的方舟子在中国以打击学术造假闻名。他在自己的网站上表示，有人向其反映重复实验结果失败，并宣称韩春雨的论文不具备可重复性。由此，网上开始出现大量对韩春雨的批评和质疑声。

方舟子表示关于NgAgo的论文不具备可重复性。图片来源：NYT

7月29日，来自澳大利亚国立大学的基因学家Gaetan Burgio，在博客上详细描述了他重复韩春雨实验结果失败的过程。他的博客一般只有几十的阅读量，但那篇博文居然被点击了超过5000次。此时，关于韩春雨研究成果的争论上升到国际层面。

Gaetan Burgio在博客上公布了重复NgAgo失败的细节。图片来源：JCSMR

在同一天，来自西班牙国家生物技术中心的基因学家Lluís Montoliu，发邮件给国际转基因技术学会（International Society for Transgenic Technologies）的同事，建议“放弃所有与NgAgo有关的任何尝试，”以“避免浪费时间、资金、实验动物和人力。”这封电子邮件意外流出，并被方舟子公布在个人网站上。

基因学家Lluís Montoliu建议放弃所有与NgAgo有关的项目，图片来源：JCSMR

来自英国爱丁堡再生医学研究中心（Centrefor Regenerative Medicine in Edinburgh）的分子生物学家Pooran Dewari发起的在线调查显示，目前只有9位学者表示NgAgo有效，97位学者表示无法重复。

印度新德里CSIR基因组与综合生物学研究所（CSIR-Instituteof Genomics and Integrative Biology）的分子生物学家Debojyoti Chakraborty曾表示他重复出了韩春雨论文的一部分结果， DT君曾第一时间给Chakraborty博士写信求证。他在回信中确了使用NgAgo技术剪辑了海拉细胞（HeLa，传说中的不死细胞）中GFP（绿色荧光蛋白）的相关序列，并观测到了细胞中的GFP减少的现象，初步确认了剪辑技术发生了作用。但经过DNA测序，并没有发现基因编辑的证据。他后来也表示荧光减弱可能是其他原因导致的。

Debojyoti Chakraborty博士当时给DT君的回复。图片来源：DeepTech深科技           

来自海德堡德国癌症研究中心（German Cancer Research Center）的遗传学博士Jan Winter表示自己也有类似经历：“我会在未来几周重复这一实验，不过目前来看，我认为不会成功。”               

韩春雨表示，他只能在自己实验室培养出的细胞上实验成功，用买来的细胞则会失败。后来他发现买来的细胞被支原体细菌污染，并推断其他人可能也遇到了同样的问题。他还补充，有些研究生实验过程可能太快，忽视了对试剂的保护。Winter对此则表示反对：“我不认为是科学家们做错了什么才导致实验失败的。”

一位来自中国的科研人员向《Nature》介绍了自己的研究进展，他本人与韩春雨团队没有任何关系，也不想透露自己的身份，以避免卷入争议。他声称已经在几种不同细胞上测试了NgAgo技术，并成功引发了目标点位的基因突变，这一发现已经由基因测序证实。但他也补充道，目前NgAgo的效率要低于CRISPR–Cas9，需要进行调整来进一步提高效率。“但无论如何，方法毕竟是有效的。”他说。

图片来源：Nature

另有两位不愿透露姓名的中国学者也表示，他们的实验结果已初步表明NgAgo有效，不过还需通过基因测序来进一步确认。

 “它可能会有效，我说的是可能，”Burgio说，“不过即便如此，NgAgo的挑战太大，不太值得去深入研究。基本上不可能超越CRISPR。”

荷兰瓦赫宁根大学（Wageningen University）微生物学家John Vander Oost则表示，NgAgo的失败“可能令人失望，不过这也为我们今后的工作开辟了一个方向，去寻找其他Argonaute系统是否有成功的可能性。”John Vander Oost是2014年Argonaute蛋白质分析报告的联合作者，这份报告为后来Argonaute用于基因编辑奠定了基础。

本周，《Nature Biotechnology》发出声明，表示“一些学者”已经与他们联络，并报告无法重复实验结果，目前“本刊正按照规定程序调查此事”。新闻发言人拒绝对事件本质作出评论，也未透露调查的时间表。

根据中国官方媒体的消息，河北科技大学会要求韩春雨重复实验，以期在一个月内，通过独立第三方的参与来对实验进行验证。

参考：

http://www.nature.com/news/replications-ridicule-and-a-recluse-the-controversy-over-ngago-gene-editing-intensifies-1.20387

Nature 536,136–137 (11 August 2016) doi:10.1038/536136a

F. Gao et al.NatureBiotechnol. 34, 768–773; 2016

D. C. Swaarts etal. Nature 507,258–261; 2014

NY Times、JCSMR

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