为了直接评估PAL对AS发展的影响，高脂肪饮食喂养雄性ApoE-/-小鼠每天给予不同浓度的PAL或PBS持续8周（图1A）。与PBS处理的HFD组相比，用高剂量PAL处理的小鼠的体重显著降低（图1B）。主动脉影像分析表明，补充PAL后以剂量依赖性方式显著减轻AS（图1C）。此外与HFD组相比，PAL处理后的小鼠的斑块面积变小（图1D）。主动脉窦病变区域的H&E染色证实，PAL处理组在斑块中表现出坏死核心区域减少（图1E）。此外在PAL处理后检测到平滑肌细胞的增加以及巨噬细胞和T细胞浸润的减少，表明动脉粥样硬化斑块的稳定性增加（图1F-H）。此外我们还评估了AS的潜在危险因素，包括肝脏和腹部脂肪组织，如图S2A和图S2B所示，PAL治疗减轻了腹部脂肪堆积，但没有改变肝脏脂肪变性或肝脏重量。

动脉粥样硬化斑块的标志是全身代谢紊乱，这主要归因于糖脂代谢失调和炎症。因此我们对小鼠的血清生化指标进行了评估，结果显示给予PAL可显著降低血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，但不降低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平（图2A）。据报道HFD造模后全身葡萄糖代谢会受损。值得注意的是，高剂量PAL治疗导致ApoE-/-小鼠的血糖水平显着改善（图2B）。给予PAL后对回肠远端的GLP-1表达没有影响（图S2C）。此外我们发现PAL呈剂量依赖性地改善HFD诱导的血浆IL-1β和IL-6水平升高，高剂量PAL组的TNF-α浓度显著降低（图2C）。

为了证明肠道菌群在介导HFD诱导的AS及其相关代谢紊乱中的关键作用，我们研究PAL的改善作用是否受到ApoE-/-小鼠肠道菌群缺失的影响。采用抗生素“鸡尾酒疗法”用于确定肠道菌群对改善AS和PAL引起的相关代谢紊乱的贡献（图3A）。给药抗生素则减弱了PAL对TC和TG水平的影响（图3B）。值得注意的是，肝脏生化分析显示肝脏TC和TG水平降低，但这些影响部分被抗生素治疗消除。抗生素治疗减弱了PAL治疗对减少斑块中脂质沉积的影响（图3C）。抗生素治疗也能逆转AS-PAL小鼠坏死核心面积的减少。（图3D）。我们通过与PAL相关的SMC含量测试以及巨噬细胞和T细胞浸润测试来评估斑块稳定性，结果发现抗生素治疗可部分降低斑块稳定性（图3E-G）。然而PAL降低IL-1β、IL-6和TNF-水平的能力不受抗生素治疗的影响（图3H）。因此研究揭示了微生物群缺失则会部分消除PAL对AS的保护作用。

接下来该研究使用16S rRNA基因测序证实PAL对肠道菌群结构的调控作用。主成分分析（PCoA）显示肠道微生物群的组成和丰度存在显著差异（图4A）。以Chao1指数为特征的α多样性，在PAL处理8周后，随着剂量依赖性方式显着降低（图4B）。LDA评分≥3.0的LEfSe分析表明，HFD组富集了 Desulfovibrio piger（D.piger） 、嗜酸乳杆菌和 Flavonifractor plautii ，而梭状芽孢杆菌、解木聚糖梭菌、肠道巴氏杆菌、嗜粘蛋白阿克曼氏菌、 Clostridium glycyrrhizinilyticum 和 Eisenbergiella tayi 在HFD-PAL组中富集（图4C）。随后通过PICRUSt2分析预测KEGG通路集中基因的相对丰度（图S3A-D），揭示了PAL处理后微生物代谢，特别是氨基酸代谢的显着差异（图S3C）。根据KEGG功能谱发现，几乎所有氨基酸的代谢，包括苯丙氨酸代谢和支链氨基酸代谢，都受到PAL处理的影响（图S3D）。然后我们进行Spearman相关分析，探讨氨基酸代谢途径相对丰度与AS相关代谢紊乱指标（主动脉斑块面积、脂质水平和炎症因子）之间的关联。结果表明，微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢的相对丰度与主动脉斑块面积、IL6、TNF-α和TC水平呈正相关，而与HDL-C水平呈负相关（图4D）。并且PAL处理显著降低了基于KEGG -L3功能特征的微生物苯丙氨酸和酪氨酸代谢（图4E-F）。此外根据中国队列数据库测量了 D. piger 与ASCVD患者之间的相关性，该数据库显示ASCVD患者肠道中宏基因组连锁群20365（注释为 D. piger 的一种）的丰度高于其他患者，并且与微生物苯丙氨酸代谢呈正相关（图 S4A-C）。同样PAL处理降低了PDH的丰度，PDH是参与苯丙氨酸代谢的微生物酶编码基因簇（图S5）。因此我们提出 D. piger 和微生物苯丙氨酸代谢对于介导PAL的抗AS作用至关重要。

PAL治疗在调节肠道微生物组方面显示出显着的疗效，这促使研究其对微生物代谢物的影响，尤其是由微生物组调节的代谢物。血清样本的代谢组学分析显示，与HFD组相比，PAL治疗诱导的代谢发生了显著的改变（图5A）。值得注意的是，热图显示所有三组中30种代谢物主要受PAL处理调节（图5B）。通路富集分析突出了与苯丙氨酸代谢、组氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰基-tRNA生物合成、精氨酸生物合成、亚油酸代谢和氮代谢相关的代谢途径（图5C）。此外随机森林分析表明，马尿酸（HA）是微生物苯丙氨酸代谢物（3-苯丙酸[PPA]和苯甲酸）的衍生物，在给予PAL后则发生显著变化（图5D）。具体而言，PAL组血清HA和PPA水平比HFD组呈剂量依赖性降低（图5B）。然后进行Spearman相关分析，以研究差异丰度代谢物与AS相关代谢紊乱指数之间的关联。结果表明，微生物苯丙氨酸代谢与AS关代谢紊乱的正相关性最强（图5E）。此外我们评估了美国主要不良心血管事件队列的HA血清水平，这表明HA水平呈升高趋势（图S4D）。综上所述，这些发现表明PPA和HA可能是参与介导PAL抗AS作用的潜在候选代谢物。

为了验证PAL对 Di. piger 生长的影响，我们分析了 D. piger 在不同剂量PAL的培养基中的生长曲线。结果表明PAL补充剂以剂量依赖性方式显著减弱了 D. piger 的生长（图6A）。随后探讨了 D. piger 是否可以代谢苯丙氨酸，并观察到孵育12小时后PPA水平增加（图6B）。此外通过在M9培养基中加入苯丙氨酸进行了微生物培养实验（图6C），与 D. piger 孵育12小时后，PPA水平显著增加，表明其能够将苯丙氨酸转化为PPA。此外在接种 D. piger 后检测到其他苯丙氨酸代谢物，并观察到苯乳酸、苯丙烯酸和苯丙酸水平的增加，同时观察到苯丙氨酸水平的相应降低（图6D，图S1B）。为了进一步验证 D. piger 是否在体内代谢苯丙氨酸，使用四种抗生素方法建立了假无菌小鼠，发现 D. piger 成功定植小鼠肠道（图S6A）。此外发现 D. piger 管饲小鼠血清中PPA和HA水平显着升高（图S6B、C）。以上结果表明 D. piger 是体内血清中HA水平升高的主要微生物。

AS是由脂质积累和炎症反应之间的相互作用触发的一种慢性血管功能障碍。巨噬细胞在驱动AS的进展中起着至关重要的作用。在动脉粥样硬化斑块中，单核细胞粘附在内皮细胞上，并在细胞间粘附分子和趋化细胞因子的帮助下分化为巨噬细胞。为了进一步详细说明了HA如何影响AS，进行转录组测序以检查HA对体外THP-1细胞mRNA表达的影响。PCA分析结果显示两组之间有明显的聚集（图7A）。与对照组相比，HA组有55个基因显著差异表达，包括30个上调和25个下调基因。对HA治疗组中改变的基因生物过程的分析显示，与炎症反应相关的基因表达紊乱（图7B）。具体而言，HA处理增加CXCL10、CXCL11、CXCR4、IL23A和IDO1的相对mRNA表达（图7）。KEGG富集分析还显示，这些差异表达基因（DEGs）主要富集在TNF信号通路和细胞因子受体相互作用中（图7D-E）。所有DEG的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析显示，PPI以三个主要节点簇为中心，代表免疫（例如CXCL10、CXCL11、CXCR4和IL23A）、氨基酸代谢（例如TDO2、IDO和SDS）以及细胞粘附和细胞凋亡（例如SERPINE1、THBS1和FN1）（图7F）。特别是，与p53信号通路相关的SERPINE1与其他基因的相关性最高，并且被HA处理下调。先前的一项研究表明，巨噬细胞中p53信号通路的缺失会导致AS发育加速和组织坏死。最后通过qRT-PCR确认了样本中7个候选DEGs的表达。所有基因的表达与RNA-seq测定的转录本丰度变化一致（图7G）。我们通过qRT-PCR进一步检查了与巨噬细胞炎症和动脉粥样硬化生成相关的其他炎症因子和趋化因子。结果显示HA主要上调趋化因子MCP1和CXC3CL1的mRNA表达（图7H）。

为了进一步评估HA对AS进展的影响，将HA添加到饲喂ApoE-/-小鼠的高脂饮食（80 mg/kg）中，持续12周（图8A）。将正常食物喂养的C57BL/6 J小鼠和高脂肪饮食喂养的ApoE-/-小鼠（HFD组）分别设计为阴性和阳性对照。与HFD组和Chow组相比，HA组表现出更高的体重（图8B）。HA组表现出更大的主动脉斑块面积（图8C）。H&E染色和α-SMA染色分别显示HA组主动脉斑块上的坏死核心较大和纤维变薄（图8E-F）。补充HA可显著增加主动脉斑块的面积和不稳定性（图8C-G）。与Chow组和HFD组相比，HA组研究巨噬细胞浸润加速（图8F-G）。

此外，脂质和炎性细胞因子的浓度与AS进展呈正相关。HA加速了HFD诱导的TG、TC和LDL-C疾病（图9）。同时，HA组炎性细胞因子IL-6和TNF-α比其他组升高更多（图9B）。

PAL是一种异喹啉生物碱，提取自小檗科、毛茛科和紫苏科等多种草本植物中。PAL的药理特性包括抗菌和抗原虫活性、胃肠保护和肝脏保护活性以及抗炎作用。因此PAL是治疗代谢综合征、细菌性炎症以及其他由炎症和氧化应激引发的疾病的潜在候选疗法。我们发现PAL能明显减轻脂质沉积，减少坏死核心面积，并抑制高脂饮食诱导的动脉粥样硬化斑块中炎症细胞的浸润。此外我们还研究了PAL对改善血清脂质和血糖水平以及降低循环炎症细胞因子的显著影响。值得注意的是PAL在体内外都诱导了微生物群的重组，尤其是 D. piger ，并降低了微生物介导的代谢物HA的丰度，HA是微生物苯丙氨酸代谢物的衍生物。此外我们通过使用抗生素“鸡尾酒疗法”消除肠道微生物群，证实了肠道微生物群在PAL介导的抗AS作用中的关键作用。

随后我们发现PAL能以剂量依赖的方式抑制 D. piger 的生长。从功能上讲 D. piger 能够在体外将苯丙氨酸转化为PPA。补充HA会加重体外炎症反应，这可能会加速AS的发展。为了进一步验证这一结论，我们研究了HA对AS体内进展的影响。结果发现，HA增加了体重、主动脉斑块的面积和不稳定性以及巨噬细胞的浸润。此外补充HA会增加LDL-C、TG和TC的水平，以及血清中IL-6和TNF-α的水平。此外我们还分析了美国队列血浆中的HA水平，结果也表明HA与晚期人类强直性脊柱炎和重大心脏不良事件之间存在独立关联。结果证实，在老龄人口中，HA的浓度会显著增加。

慢性低度炎症是强直性脊柱炎的关键驱动力，并伴随着内皮功能障碍和炎症细胞向斑块的浸润。免疫和炎症介质调节的多种信号通路参与了动脉粥样硬化病变的进展。CXCL10、CXCL11和CXC3L1是动脉粥样硬化发生的潜在介质，可促进炎症细胞浸润、病变增大和斑块破裂。此外CC基序趋化因子配体2/MCP-1轴协调动脉粥样硬化病变和血液循环之间的炎性单核细胞迁移，被认为是AS的潜在靶点。

近年来宿主与肠道微生物群在慢性阻塞性肺病中的内在相互作用逐渐被揭示。宿主-肠道微生物群协同代谢被认为是一种新的病理机制和治疗靶点。Changtao Jiang等人发现微生物二肽基肽酶4 (DPP4)由微生物群中特定的菌群表达，是一个潜在的抗糖尿病靶点。宿主与微生物群之间的相互作用是生物和病理条件下免疫系统发展的基础，在这方面已经取得了多种进展。大规模多组学的巨大进步使得构建ASCVD患者体内生物代谢物的分子图谱成为可能，但人们对这些分子变化与ASCVD的疾病进展和预后之间的功能关系的内在机制仍然知之甚少。与此同时，候选方法揭示了由菌群调控的功能性信号分子，但这些候选代谢物在多大程度上代表了促进ASCVD进展的关键介质尚未确定。宿主会产生多种通过肠道微生物群在血液中循环的小分子，如HA、TMAO和胆汁酸。它们与生物或病理信号分子积聚在相当的水平，并影响宿主的生理机能。膳食中的苯丙氨酸进入PPA的代谢途径依赖于肠道微生物群，对苯乙酰谷氨酰胺的产生至关重要，而苯乙酰谷氨酰胺是导致急性心血管疾病的潜在危险因素。另一项研究表明，运动诱导的N-乳酰基苯丙氨酸可抑制进食和肥胖。

总之，PAL通过调节肠道微生物群-苯丙氨酸代谢轴，恢复肠道微生物群和微生物苯丙氨酸代谢的平衡，表现出抗AS的作用。具体来说，PAL可抑制特定肠道微生物群（如 D. piger ）的生长，降低血清中来自微生物苯丙氨酸代谢的HA和PPA水平，从而改善与强直性脊柱炎相关的炎症反应和代谢失调。在体内补充HA会加速强直性脊柱炎的进展、脂质功能障碍和炎症细胞因子。此外本研究中PAL的低剂量（33 mg/kg/d）、中剂量（66 mg/kg/d）和高剂量（132 mg/kg/d）分别对应于人体的临床剂量约3.6 mg/kg/d、7.3 mg/kg/d和14.7 mg/kg/d。这些PAL剂量将为进一步的临床试验提供有用的参考，以验证PAL是治疗ASCVD的潜在临床候选药物。