基因治疗和细胞治疗作为现代个性化医学的重要支柱，正迅速发展。然而，这些疗法需要一种能够精确、可逆且患者友好的控制方式，以实现治疗蛋白的按需生产。为此，研究人员需要开发一种能够通过安全、便捷的触发化合物来动态调控治疗蛋白表达的基因开关。理想的基因开关应具备生物可利用性、易于给药、无多效性副作用，并且能够长期、可逆地调控基因表达，同时最小化对宿主代谢的干扰。
一氧化氮（NO）是一种在人体中具有多种生物学功能的气体信号分子，其在心血管活动、免疫反应和中枢神经系统稳态中发挥关键作用。NO的前体药物硝酸甘油（NG）已被广泛用于治疗心绞痛和慢性心力衰竭。NG通过人体内的线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）转化为NO。
成果简介
基于上述特性，
苏黎世联邦理工学院
Martin Fussenegger等
研究人员
设计了一种完全人类化的
NO
响应型基因调控系统（
hNORM
），通过经皮给药的
NG
贴片实现治疗蛋白的按需释放。
该系统利用人类线粒体
ALDH2
将
NG
转化为
NO
，激活可溶性鸟苷酸环化酶（
sGC
），进而通过蛋白激酶
G
（
PKG
）放大信号并触发目标基因表达。
研究人员在肥胖型
2
型糖尿病小鼠模型中验证了该系统的有效性。
实验中，表达
hNORM
系统的人类细胞被封装后植入小鼠皮下，通过在植入部位上方放置
NG
贴片，实现了
35
天内对胰高血糖素样肽
-1
（
GLP-1
）的可控、可逆表达，有效恢复了小鼠的血糖水平，且未对心率或血压产生影响。
这一成果为开发安全、便捷的植入式设备用于慢性疾病管理提供了新的思路。
图1 | hNORM在哺乳动物细胞中的分子组成和作用机制的示意图
hNORM
在哺乳动物细胞中的表现
研究人员首先在HEK-293细胞中验证了hNORM系统的功能。通过共转染sGC、PKG1和合成启动子PCRE驱动的报告基因SEAP，发现NO供体（如DETA
NONOate和SNAP）能够诱导SEAP的表达，但只有在共表达PKG1时才有效。
这表明PKG1对于hNORM系统的功能至关重要。此外，hNORM系统在多种人类和啮齿动物细胞系中均表现出良好的诱导效果，其中HEK-293细胞表现最佳。
稳定hNORM转基因人类细胞系的生成与表征
为了进一步研究hNORM系统的体内应用潜力，研究人员构建了一个稳定表达hNORM组件的HEK-293细胞系（HEK
hNORM1
）。该细胞系在DETA NONOate诱导下表现出低泄漏和强大的诱导能力（135倍诱导）。
此外，hNORM系统的启动速度较慢，需要较长时间的NO暴露才能实现显著的基因表达
。通过实时显微镜分析，研究人员确认了这一现象。
图2 | hNORM在哺乳动物细胞中的工程化
线粒体ALDH2增强hNORM的体内性能
为了验证NG贴片是否能够通过皮肤给药实现hNORM系统的体内控制，研究人员将HEK
hNORM1
细胞封装后植入小鼠皮下，并在其上方放置NG贴片。
结果显示，不同剂量的NG贴片能够精确控制目标蛋白的产生和系统性递送。
为了提高NG的转化效率，研究人员进一步构建了过表达ALDH2的HEK
hNORM2
细胞系。
结果表明，ALDH2的过表达显著增强了hNORM系统的NG敏感性和体内性能。
图3 |
hNORM显示出高效率和可调节性，可通过甲苯蓝阻断
hNORM
控制的可逆性和局部性
研究人员发现，NG的短半衰期（约5分钟）使得hNORM系统的控制具有高度的时空特异性。
当NG贴片远离植入部位或在腹腔内植入细胞时，未检测到系统性NLuc的表达，表明hNORM系统对NG贴片的响应具有短距离特异性
。此外，通过反复应用和移除NG贴片，研究人员证实了hNORM系统在体内的可逆性、稳健性和可靠性。
图4 |
线粒体ALDH2增加NG贴片诱导的NLuc释放
NG
贴片控制的GLP-1表达恢复2型糖尿病小鼠的血糖稳态
研究人员进一步利用hNORM系统在2型糖尿病小鼠模型中实现了GLP-1的按需表达。他们构建了一个稳定表达GLP-1的HEK
hNORM3
细胞系，并通过封装后植入小鼠皮下。
实验中，通过NG贴片诱导GLP-1分泌，显著降低了血糖水平，并在35天内维持了血糖稳态
，且未对心血管参数产生影响。此外，GLP-1的表达还改善了胰岛素抵抗，降低了体重，并恢复了小鼠的葡萄糖耐受性。
图5 |
hNORM调控的GLP-1分泌有效降低2型糖尿病小鼠的血糖水平，且不影响血压或心率
