香港科技大学曾超华团队和内华达大学Eakalak Khan CEJ：结合生物炭强化与乙酸补充提升富含乳酸废水厌氧发酵性能的策略

图文摘要

成果简介

近日，香港科技大学曾超华教授团队和内华达大学 Eakalak Khan 教授在环境领域著名学术期刊 Chemical Engineering Journal 上发表了题为“ Strategy to improve anaerobic fermentation performance of lactate-rich wastewater by combining biochar augmentation and acetate supplementation ”。富含乳酸的废水在厌氧发酵（ AF ）过程中，由于系统不稳定和氧化还原失衡等问题，其氢气产量一直受到限制。为此，本研究提出了一种结合生物炭强化与乙酸补充的策略，旨在提升富含乳酸废水的厌氧发酵性能，并探索其能量回收潜力。经过 7 轮发酵后，乳酸的消耗率达到了 99.9% ，同时累积氢气产量从 29.2 ± 1.6 mL/g COD 显著提升至 94.2 ± 2.8 mL/g COD 。此外，附着在生物炭上的生物膜被重新用作后续六轮发酵的接种物。研究结果表明，生物炭能够有效固定功能产氢菌，并且在 7 个发酵循环中，添加生物炭的实验组相比对照组表现出更稳定的氢气产量提升。代谢组学和宏基因组学分析揭示生物炭可以激活与电子传递相关的腺苷三磷酸（ ATP ）合成，从而克服固有的热力学限制，实现复合物 I 与乳酸脱氢的耦合反应。结果表明， ATP 水平提升了 51% ，这为细胞增殖和酶促反应提供了支持。在此基础上，乙酸能够通过微生物链延长过程促进乳酸的利用，从而弥补能量回收的不足，并激活电子分岔复合物的功能。该复合物能够在氧化 NADH 的同时还原铁氧还蛋白，进而增强铁氧还蛋白氢酶以维持氢气的生成。这些新发现及其机制解析为生物质废弃物资源化利用和绿色氢气生产提供了可持续的解决方案 。

能源危机和废物处理问题对环境和全球经济发展产生了负面影响。厌氧发酵（ AF ）技术因其能够从有机废物中生产清洁能源（如氢气）和化学前体（如挥发性脂肪酸）而受到广泛关注。微生物通过代谢反应降解和合成分子以获取能量，并通过调节还原力流动来维持细胞稳态。然而，频繁的底物更替、功能微生物的流失以及严重的酸冲击对发酵细菌的代谢稳定性构成了重大挑战。此外，进水底物中潜在的抑制剂进一步增加了系统稳定性的维护难度。乳酸是厌氧发酵过程中常见的抑制物，其难以用于氢气生产。高浓度乳酸会阻碍微生物对碳水化合物的利用，同时使维持氧化还原稳态变得困难，因为有机分解的稳定进行依赖于 NADH 氧化以快速再生 NAD ⁺ 。因此，在富含乳酸的废水厌氧发酵过程中，氧化还原失衡常常导致系统崩溃和底物利用停滞。研究表明，外源添加乙酸能够促进乳酸转化为丁酸并释放氢气。在这一链增长过程中，厌氧微生物通过将短链羧酸盐与还原性更强的化合物结合来获取能量。尽管乙酸能够富集产氢菌，但系统不稳定性问题仍未得到彻底解决，因此需要探索新的策略 。

生物炭是一种通过热解生物质废物制得的富碳材料，具有调节微生物碳代谢和氧化还原状态的潜力。生物炭可作为电子受体促进 NADH/NAD ⁺ 的转化，增强微生物对外部扰动的耐受性。它在增强电子分叉复合体（ Etf/Bcd 复合体）活性中起关键作用， Etf/Bcd 复合体通过耦合放能和吸能反应最小化能量损失，并参与乳酸代谢中的反向β - 氧化途径。因此，我们假设生物炭能够通过促进 Etf/Bcd 复合体的功能来驱动乳酸转化用于氢气生产。生物炭的多孔结构和表面疏水性被认为有利于微生物定殖。值得注意的是，生物炭为微生物提供了适宜的栖息地，而生物炭相关的生物膜为厌氧发酵过程提供了一种创新且可再生的途径。然而，迄今为止，关于生物炭相关生物膜在厌氧发酵系统中持续性能的研究还很少。因此，本研究探讨了乙酸是否能驱动乳酸的产氢链延长，以及生物炭是否能作为维持微生物固定化的平台，刺激能量守恒和 NADH/NAD ⁺ 的周转。通过试验评估了不同条件下厌氧发酵的性能，并评估了生物炭相关生物膜的可回收潜力。研究结果为未来研究和富含乳酸废水处理的新实践提供了机制上的见解。

图文导读

图 1. (a) 7 个发酵循环中的乳酸、 VFA 浓度和氢气产量， (b) 不同条件下的乳酸消耗速率（ GL 为对照反应器， GLB 为生物炭强化反应器， GLA 为补加乙酸的反应器， GLAB 为生物炭强化和补加乙酸的反应器）。

图 1 （ a ）显示在第 1 轮发酵中，对照组（ GL ）的累计氢气产量仅为 23.2 ± 2.0 mL/g COD 。相比之下，处理组的累计氢气产量显著增加，分别达到 72.9 ± 2.8 mL/g COD （ GLB ）、 28.4 ± 2.7 mL/g COD （ GLA ）和 75.1 ± 6.5 mL/g COD （ GLAB ）。在第 1 轮发酵后，附着在生物炭上的生物膜被分离出来，并作为接种物用于后续周期。如图 1a 所示，生物炭增强组（即 GLB 和 GLAB ）在七个周期中累积氢气产量相较于对照组（ GL ）有显著提高。此外，图 2 （ b ）显示在对照反应器中， 7 轮发酵中乳酸消耗率为负，范围在 −3.7% 到 −28.1% 之间（如图 1b 所示），这种额外的乳酸生成可能来源于糖酵解反应中的丙酮酸转化，并会产氢途径竞争来自葡萄糖的电子流。相比之下，生物炭的增强显著促进了乳酸转化为丁酸。因此， GLB 组在第 7 轮发酵的乳酸消耗率上升至 35.0 ± 3.1% 。值得注意的是， GLAB 组在挥发性脂肪酸（ VFA ）组成上发生了显著变化，其中丁酸成为主要的 VFA 成分，而乳酸几乎被完全消耗 。

图 2. （ a ）第 7 轮发酵中不同条件下蛋白质（绿色）和 PNAG （红色）的 3D CLSM 图像（从左到右分别为 GL 、 GLB 、 GLA 和 GLAB 组的样品），以及相对于对照组（ GL ）的生物膜含量比较，（ b ）第 7 轮发酵中提取的 EPS 的 3D-EEM 光谱。

通过 CLSM 可视化不同条件下生物膜的形成，分析生物膜成分的空间分布。图 2a 显示，蛋白质作为生物膜基质的重要组成部分，在对照组（ GL ）中的分布较为分散，仅存在于某些区域，而在处理组中观察到更多的蛋白质，特别是在 GLAB 组中，蛋白质含量比对照组高出 58.2% 。据报道，聚 - β -(1 – 6)-N- 乙酰氨基葡萄糖（ PNAG ）存在于某些细菌的细胞壁中，是生物膜形成的重要构件之一，其体积在三个处理组中相比对照反应器均有不同程度的增加。色氨酸和芳香蛋白类物质具有共振的π键环状平面结构，这赋予其疏水特性。这些芳香物质的分泌可能有助于细菌附着在高温生物炭上。因此，在 EPS 部分中，与对照组（ GL ）相比， GLB 和 GLAB 组的色氨酸类（峰 A ）和芳香类物质（峰 B ）的荧光强度明显增强（图 2 ）。这些发现表明，该策略可能促进微生物定殖和生物膜形成，增强微生物群落的功能和代谢。

图 3. （ a-c ） KEGG 拓扑分析图，以及（ d-f ）显著差异代谢通路的差异丰度分数（ p < 0.05 ）。

图 4. （ a ）不同条件在第 1 轮与第 7 轮发酵中物种水平上的微生物组成，（ b ）驱动发酵产氢过程的关键代谢通路基因丰度。

图 4 （ a ）显示了第 1 轮与第 7 轮发酵中不同条件下物种水平的微生物分布。在经过 7 轮发酵后，生物炭组中功能性产氢菌（如丁酸梭菌、未分类的梭菌属和酪丁酸梭菌）的相对丰度显著增加。具体来说， GLB 组将这三种菌的相对丰度从第 1 周期的 18.6% 提高到第 7 周期的 36.6% ，而 GLAB 组则进一步从 23.9% 提高到 43.7% 。这些发现暗示了生物炭在固定功能性微生物以实现持续应用方面的潜力。相比之下， GL 组中功能性产氢菌的相对丰度仅从第 1 轮发酵的 11.3% 略微增加到第 7 轮发酵的 18.6% 。此外，宏基因组学分析显示生物炭明显上调复合物 I 和丙酮酸代谢相关的基因丰度，而乙酸的参与则能够进一步促进乳酸代谢的后续反应。

图 5. （ a ） 7 个发酵循环中 ATP 和 Etf 的浓度以及 Bcd 活性，（ b ）第 7 轮发酵中 ETS 、 H ₂ 酶、乳酸脱氢酶（ Ldh ）和 NADH 脱氢酶的活性及铁氧还蛋白浓度，（ c ） ATP 浓度与乳酸消耗速率的相关性， Etf 浓度、 Bcd 活性和累积产氢量的相关性，以及（ d 有无复合物 I 情况下乳酸转化反应的能量机制。

通过揭示与氢气生产相关的代谢通路和基因丰度，氧化磷酸化和丁酸代谢被确定为关键上调的通路。为了进一步阐明其机制，量化了这些通路中重要的电子载体和酶复合物，以理解它们的内在关系。 ATP 是细胞内主要的能量储存和传递者，其水解驱动许多重要的代谢过程。生物炭增强显著改变了 ATP 浓度，第 7 轮发酵中 GLB 组的 ATP 浓度从 GL 组的 7.9 增加到 10.2 nmol/L ， GLAB 组则增加到 11.9 nmol/L ，这与代谢物和能量代谢基因的显著上调一致。乳酸消耗率与 ATP 浓度显著正相关（ R ² =0.93 ），表明 ATP 合成在控制乳酸命运中起关键作用。 GLB 和 GLAB 中的氧化磷酸化基因显著调节， ETS 和复合物 I 的活性显著高于 GL ，表明生物炭增强促进了更活跃的电子传递。复合物 I 驱动 NADH 氧化并还原泛醌，乳酸利用产生氢气的第一步由 Ldh 催化。生物炭可能通过调节 ATP 溢出刺激乙酸的初始转化。生物炭增强使得乳酸氧化释放的多余电子可以通过 NADH 脱氢酶进入电子传递链，最终生物炭可以作为外源电子汇，维持氧化还原平衡。在生物炭增强的反应器中观察到更高的 NAD(H) 水平和较低的 NADH/NAD ⁺ 。 Etf/Bcd 复合物能够驱动铁氧还蛋白的还原，同时氧化 NADH ，这不仅有助于维持细胞代谢的持续氧化还原平衡，还为氢气生产提供还原的铁氧还蛋白。这可能解释了累计氢气产量与 Etf 浓度（ R ² =0.89 ）和 Bcd 活性（ R ² =0.91 ）均呈正相关的现象。

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本研究提出了一种新的策略，通过生物炭增强和乙酸补充的协同作用，提高乳酸丰富废水厌氧发酵的产氢效率。结果表明，该策略显著提高了七个厌氧发酵周期中的累计氢气产量，并在第 7 轮发酵中达到了最高氢气产量 94.2 ± 2.8 mL/g COD ，远高于对照组的 23.2 ± 2.0 mL/g COD （第 1 轮）。生物炭固定的生物膜在发酵产氢中表现出可靠的可回收性。生化代谢途径的变化显示，氧化磷酸化显著上调，这使得热力学上不利的乳酸脱氢反应能够与复合物 I 的反应耦合，从而激活乳酸进入丙酮酸氧化，为氢气生成提供更多前体。此外，电子分叉复合体得到增强，使铁氧还蛋白的还原与 NADH 的氧化同时进行。这不仅维持了细胞代谢的氧化还原平衡，还为氢气生产提供了还原的铁氧还蛋白。本研究拓宽了我们对厌氧生物过程中的细胞代谢和氧化还原协调的理解，为提高生物氢生产效率和推进生物质及废水处理的可持续技术提供了实际解决方案。我们建议深入研究微生物群落的动态及其与连续厌氧发酵周期中观察到的代谢变化的关系 。