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网络药理学依然能打！福建医科大学团队，网药+分子对接+蛋白组学，干湿结合，发表1区Top期刊！可复现发文思路，不学白不学！

生信图书馆 · 公众号 · · 2024-07-25 19:00

正文

Hello!小伙伴们！你们喜爱的馆长我又来啦！近日，小朋友们都陆陆续续进入暑假模式了。但暑假对于007的科研人来说真是可望而不可即呀！没关系。馆长虽然给不了长长的假期，但可以为你们的文章出谋划策，让日子越过越红火。那么，快来看看馆长今天给大家带来的好文章。福建医科大学近期在Phytomedicine发表了一篇文章，探讨人参皂苷 Re 的抗心肌缺血作用及综合机制。人参，自古便被誉为“百草之王”的珍贵中药材，其药用价值与保健功效已经被国人研究“烂”了，下面就看看作者如何在“人参皂苷 Re ”中玩出新花样。

1.本研究构建了3种模型（氧糖剥夺、氧化诱导心肌细胞损伤和异丙肾上腺素诱导心肌缺血小鼠），确定了人参皂苷 Re 的对心肌组织的保护作用，为后续的生信分析提供实验基础。

2.本研究综合网络药理学、分子对接和蛋白质组学，预测了人参皂苷 Re 抗心肌缺血的潜在作用靶点及相关通路，是文章机制研究的主体部分。

3.本研究通过免疫荧光法和蛋白免疫印迹验证预测的的作用靶点及通路，增强了生信分析的说服力。本文思路简单，设计严谨，是典型的实验+分析+验证的文章。屏幕前的小伙伴完完全全可以把这一思路用在自己的文章中！（PS：在生信数据处理、结果分析上遇到困难的小伙伴们，欢迎大家找馆长帮忙哦~早联系早发文！快来扫码联系馆长吧~)

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题目：整合网络药理学和蛋白质组学分析，确定人参皂苷 Re 治疗心肌缺血的关键靶点通路

杂志： Phytomedicine

影响因子：IF=6.7

发表时间：2024年6月

公众号回复“666”二字可以领取本文献，文献编号：240725

研究背景

心肌缺血（MI）是临床实践中导致严重心脏损伤、心功能下降甚至心力衰竭的主要因素，使患者死亡率升高。β受体阻滞剂和他汀类药物等是目前临床治疗MI的主要药物。然而，这些药物的作用有限，往往伴有药物不良反应。在中医治疗心脏病的经典处方中，人参显示出调节全身气、恢复血液循环、增强心脏功能的功效。人参皂苷 Re 是原人参皂苷的主要代表性成分之一。在人参皂苷的众多成分中，人参皂苷 Re 的含量相对较高，易于分离和纯化，且可调节受损心肌的氧化应激水平，可能减轻心肌缺血症状，但相关机制尚未得到全面研究。故研究结合网络药理学和串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学，系统探究人参皂苷 Re 对MI的作用机制，为人参活性成分的临床应用提供更多的理论和数据支持。

数据来源

数据库	详细信息
PharmMapper	药物靶点预测
OMIM/GeneCards	筛选疾病靶点

研究思路

首先，采用氧糖剥夺（OGD）、氧化诱导心肌细胞损伤和异丙肾上腺素（ISO）诱导MI小鼠，探讨人参皂苷 Re 的保护作用。接着，采用网络药理学、分子对接和TMT蛋白质组学的综合方法确定人参皂苷 Re 抗MI的共同潜在靶点。最后，通过免疫荧光法（IF）和蛋白免疫印迹（WB）验证主要的抗MI靶蛋白及其相关通路。

研究结果

1.人参皂苷 Re 对心肌细胞的毒性

采用MTT法检测人参皂苷 Re 对H9c2细胞的毒性作用。人参皂苷 Re 与阴性对照组的细胞存活率无显著差异。（图1B）

2.人参皂苷 Re 对OGD和 H ₂ O ₂ 损伤心肌细胞的保护作用

用Na ₂ S ₂ O ₄ （8mM，溶解在低糖培养基中）成功建立OGD损伤心肌细胞模型（图1C）。然后，用人参皂苷 Re 对OGD损伤的心肌细胞进行干预，结果显示人参皂苷 Re 对心肌细胞具有剂量依赖性的保护作用（图1D）。用60µM的H ₂ O ₂ 建立H ₂ O ₂ 损伤模型（图1E）。当用人参皂苷 Re 对H ₂ O ₂ 损伤模型进行干预时，人参皂苷 Re 在一定范围内（对H ₂ O ₂ 损伤细胞表现出剂量依赖性的保护作用（图1F）。

3.人参皂苷 Re 对OGD损伤H9c2心肌细胞超微结构的影响

光学显微镜观察显示，人参皂苷 Re 不损害心肌细胞的细胞状态和形态。同时，人参皂苷 Re 能使OGD损伤心肌细胞的形态恢复正常，且效果呈剂量依赖性（图1G）。OGD诱导后ROS的产生增加，人参皂苷 Re 能使OGD损伤的H9c2细胞的ROS水平降低，且呈剂量依赖性（图1H）。DAPI染色后，OGD损伤的H9c2细胞表现出细胞凋亡的特征。人参皂苷 Re 可使细胞维持正常形态，减少细胞凋亡，且呈剂量依赖性（图1I）。使用MMP检测试剂盒检测MMP，结果显示，随着人参皂苷 Re 浓度的增加，OGD损伤的H9c2细胞的红绿荧光比值逐渐升高，MMP水平逐渐升高，线粒体功能恢复（图1J）。

图1：人参皂苷Re对心肌细胞毒性低，对OGD、H2O2损伤的心肌细胞有保护作用

4.人参皂苷 Re 对MI小鼠的保护作用

与模型组相比，人参皂苷 Re （10和20mg/kg）组体重增加（BW，p<0.05），心脏重量下降（HW，p<0.01）。计算各组的HW和BW比值（HW/BW），以降低个体分化的影响。人参皂苷 Re （5mg/kg）组与模型组的HW/BW差异无统计学意义，而人参皂苷 Re 两组（10和20mg/kg）的HW/BW均有所下降。（图2A）

5.人参皂苷 Re 对MI小鼠心电图的影响

人参皂苷 Re 干预后，随着给药浓度的增加，小鼠心电图异常逐渐改善（图2B）。与模型组相比，人参皂苷 Re 组（10和20mg/kg）的HR和QT指数显著降低，而PR指数显著回升（图2C）。

6.人参皂苷 Re 对MI小鼠血液生化指标的影响

与模型组相比，人参皂苷 Re 干预后，各组的cTnT和CRP水平均有显著改善（p<0.001）。人参皂苷 Re 组（20mg/kg）的NT-proBNP指数显著下降（p<0.05，图2D）。由图2E可知，与模型组相比，人参皂苷 Re 组（5和20mg/kg）的PT显著下降（p<0.05），APTT、TT差异无统计学意义。模型组较对照组FIB值显著升高（p<0.001），人参皂苷 Re （10和20mg/kg）干预后显著下降。另外，人参皂苷 Re 干预后，各组心肌酶水平均有不同程度的改善（图2F）。

图2：人参皂苷Re对心肌损伤小鼠生存状态及血液生化指标的影响

7.人参皂苷 Re 对MI小鼠心肌病理组织的影响

TTC染色结果（图3A）显示，人参皂苷 Re 组心脏切片的灰白色区域随着给药剂量的增加而减少，表明人参皂苷 Re 可以缓解ISO引起的缺血现象。HE染色结果（图3B）显示，人参皂苷 Re 组心肌组织病变随着给药剂量的增加而逐渐减少，心肌纤维排列更整齐，水肿和胞浆空泡化减轻。Masson和天狼星红染色结果(图3C和D)显示，人参皂苷 Re 组胶原纤维含量降低，且呈剂量依赖性。透射电镜结果（图3E)显示，随着人参皂苷 Re 浓度的增加，心肌细胞超微结构的损伤逐渐减少。

图3：人参皂苷Re对MI小鼠心脏病理改变的影响

7.网络药理学分析

如图4A所示，在“药物-靶点-疾病”网络中，人参皂苷 Re 的116个潜在靶蛋白与MI相关。对这些蛋白进行PPI分析。可视化分析结果显示，人参皂苷 Re 与潜在靶点的蛋白质相互作用涉及90个节点和214条边。如图4B所示，每个节点代表潜在作用靶点对应的蛋白质。节点越大，颜色越蓝，对应的度值越大。对PPI网络进行拓扑分析，结果显示，PPI网络中各节点的平均度值为4.76，有31个蛋白质超过平均度值。这些蛋白质属于MAPK家族和AKT等通路相关蛋白，可能是人参皂苷 Re 对抗MI的核心靶点。

将筛选出的116个潜在靶点导入DAVID生物信息学数据库进行GO功能注释分析。如图4C所示，人参皂苷 Re 抗MI的BP主要涉及蛋白质磷酸化、PI3K信号转导正调控、MAPK活性激活、ERK1/ERK2级联反应正调控、心脏发育等。人参皂苷 Re 抗MI的CC主要涉及细胞外泌体、胞外结构域、细胞质、细胞外基质、膜筏和细胞质膜。人参皂苷 Re 抗MI的MF主要涉及丝氨酸肽链核酸内切酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、类固醇激素受体活性、蛋白结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性和药物结合。

如图4D所示，KEGG分析结果显示，人参皂苷 Re 抗MI的通路可能涉及代谢通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、癌症通路、IL-17信号通路和FoxO信号通路。

利用SYBYL-X2.1.1软件的Surflex-Dock模块，将人参皂苷 Re 与筛选出的116个潜在靶点进行分子对接，筛选出9个靶蛋白。接着，利用AutoDockVina软件进一步对SYBYL筛选的9个靶蛋白与PPI网络筛选的31个核心蛋白作分子对接，预测人参皂苷 Re 与蛋白对接的结合能。结合能越低，结构就越稳定。使用PyMOL软件可视化人参皂苷 Re 蛋白结合图（图4E）。对结合能进行排序，筛选出16种蛋白，包括NOS3、GSK3β、KDR、JAK2、SRC、NOS2、KIF11、CSNK1G2、MAPK8、AMY2A、MDM2、HMGCR、FNTA、MAPK14、PTPN11和GPX4。（PS：网络药理学分析为本文机制研究指明方向！做机制研究的小伙伴，网络药理学用起来。有不懂的地方都可以私聊馆长哦~)

图4：网络药理学分析与分子对接

8.蛋白质组学结果

人参皂苷 Re 干预后，MUP1、Osbpl6、Igh-1a、Caspase9、Dnah12和MUP2的表达水平上调，而Orm2、Saa2、Hp、Serpina3g和Tgtp2的表达水平下调（图5A和B）。这表明人参皂苷 Re 通过调节内质网应激、铁死亡、免疫和炎症来缓解小鼠MI。人参皂苷 Re 干预位点主要分布在细胞外、细胞质和细胞核（图5C），与共聚焦显微镜观察到的亚细胞结构靶点一致。进一步对人参皂苷 Re 和模型组的92个DEPs进行GO富集分析，根据筛选条件获得30个GO项，结果见图5D和E。GO富集分析表明，DEPs主要集中在细胞外区和囊泡区，参与免疫反应、炎症等生物过程的调控。通过数据库比对，对DEPs的COG/KOG同源蛋白簇进行功能分类。COG/KOG分类显示，人参皂苷 Re 干预后发生改变的蛋白主要富集在细胞过程和信号转导中，参与基因转录、重组和复制（图5F）。KEGG通路富集结果（图5G）显示，人参皂苷 Re 干预后DEPs在抗凋亡、PI3K-AKT通路、免疫炎症反应、TGF-β通路、抗肿瘤等通路上存在显著差异。此外，人参皂苷 Re 干预显示抗铁死亡相关信号通路的富集。其中，通过网络药理学筛选PI3K-AKT通路、细胞凋亡通路、TGF-β和铁死亡相关信号通路靶点。结果进一步表明，它们可能是人参皂苷 Re 抗MI的核心靶点。

图5：人参皂苷Re保护MI小鼠心肌组织的蛋白质组学筛选数据

8.IF和WB分析

探讨MAPK通路相关蛋白及其磷酸化蛋白（包括ERK、JNK和P38）在人参皂苷 Re 抗MI过程中的表达水平。由图6A和B可知，与OGD损伤的心肌细胞相比，人参皂苷 Re 低、中、高浓度组ERK、JNK和P38的磷酸化水平降低。在缺血损伤心肌组织中，WB验证了MAPK通路核心蛋白JNK、P38及其磷酸化蛋白的表达水平，结果与IF的表达结果一致（图7A和B）。这表明人参皂苷 Re 可以通过抑制MI过程中MAPK通路相关蛋白的磷酸化来发挥抗MI的作用。

图6：各组心肌细胞OGD模型中人参皂苷Re抗MI过程中MAPK和铁死亡通路相关蛋白（包括ERK、JNK、P38）及其磷酸化蛋白的表达

图7：MI过程中与MAPK、AKT、AMPK和铁死亡通路相关的蛋白质的表达

探讨PDPK1/AKT/TGF-β3、STAT3（JAK2的重要下游蛋白）及其磷酸化蛋白在人参皂苷 Re

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