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结膜黑色素瘤糖酵解产生的乳酸通过聚集和极化巨噬细胞促进血管生成

BCML速递 · 公众号 · · 2024-11-10 22:00

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结膜黑色素瘤（ CoM ）是一种罕见但致命的眼癌。原发性 CoM 肿瘤表达血管内皮生长因子（ VEGF ）并募集促肿瘤发生的 M2 样巨噬细胞。然而，由于缺乏合适的模型，血管生成在 CoM 转移扩散中的作用仍然未知。该研究发现 CoM 细胞具有高度糖酵解性并分泌乳酸，乳酸会募集和极化人类和斑马鱼巨噬细胞，使其向 M2 样表型发展。这些巨噬细胞会提高肿瘤微环境中促血管生成因子（如 VEGF 、 TGF-β 和 IL-10 ）的水平，从而诱导体内对植入的 CoM 细胞产生血管生成反应。消融斑马鱼巨噬细胞或抑制 CoM 细胞的糖酵解会终止这种反应，这表明乳酸依赖性巨噬细胞会被 CoM 细胞所吸引且驱动血管生成，并可能是 CoM 细胞的播散机制之一。

为了探索结膜黑色素瘤细胞是否能触发巨噬细胞依赖性血管生成，研究者应用了斑马鱼肿瘤异种移植血管生成实验，并在 16-24 小时后对血管生成活动进行成像。肿瘤细胞的植入诱导了来自肠下静脉丛（ SIV ）的血管生长，引发了 SIV 复合物的发芽和重塑。利用绿色荧光蛋白（ EGFP ）标记巨噬细胞，结果显示巨噬细胞快速募集到植入细胞的位置，并与癌细胞共定位。这些结果表明 CoM 细胞系在斑马鱼异种移植模型中均具有高血管生成活性，与巨噬细胞募集相关（图 1 ）。

为了研究巨噬细胞募集在血管生成发展过程中对 CoM 细胞的功能影响，研究者使用 NsfB 硝基还原酶（ NTR ） / 甲硝唑（ MTZ ）消融系统来消耗活斑马鱼胚胎中的巨噬细胞。结果显示 CoM 细胞系的植入诱导巨噬细胞募集和血管生成，但用 MTZ 化学消融巨噬细胞后血管生成反应降低。研究者使用斑马鱼特异性引物通过 qPCR 定量了移植斑马鱼幼虫中促血管生成、促炎和 M2 标志物的表达水平（图 2 c-f ）。结果显示注射 CoM 细胞系的组中 VEGF-A 、 TGF-β 和 IL-10 等促血管生成因子过度表达，但如果巨噬细胞被消融，这些基因的表达就会降低（图 2 d ）。 M2 标志物 IL-4 也具备相似的表达模式（图 2 e ）。这些结果表明，转移性结膜黑色素瘤细胞植入引起的血管生成是巨噬细胞依赖性的，并且募集的巨噬细胞在肿瘤细胞附近向 M2 样阶段极化（图 2 ）。

癌细胞糖酵解产生的乳酸会吸引巨噬细胞来促进血管生成反应。为了验证这种可能性，研究者首先研究了斑马鱼巨噬细胞是否能够像哺乳动物巨噬细胞一样感知乳酸。研究者发现注射乳酸显著增加了斑马鱼后脑中积累的巨噬细胞数量，表明乳酸确实可以驱动斑马鱼巨噬细胞迁移（图 3b ）。接着，研究者测试了高度糖酵解的恶性细胞是否能有效吸引斑马鱼体内的巨噬细胞。为此，研究者使用了两种参考同源乳腺癌细胞系：高度转移性的糖酵解 4T1 细胞和非转移性的低糖酵解 67NR 细胞。同源转移性变体 4T1 引起了显著的血管生成反应并募集了更多的巨噬细胞，且其血管生成效果依赖于巨噬细胞，巨噬细胞是斑马鱼血管生成因子表达所必需的（图 3 ）。

鉴于乳酸可能对血管生成产生影响，研究者进一步探究了 CoM 细胞系是否也会分泌乳酸来控制巨噬细胞募集和极化，从而诱导斑马鱼模型中的血管生成。 2- 脱氧 -D- 葡萄糖（ 2DG ）通过竞争性抑制己糖激酶 1 （ HK1 ）来阻断糖酵解， GSK2837808A （ GSK ）则抑制脱氢酶 A （ LDHA ），脱氢酶 A 可将丙酮酸转化为乳酸。用这两种抑制剂分别处理 CoM 细胞系 CRMM1 、 CRMM2 以及 4T1 细胞 24 小时，高度糖酵解的 4T1 细胞以及 CRMM1 和 CRMM2 细胞的乳酸分泌显著降低至 67NR 非糖酵解细胞的水平，这表明 CoM 细胞确实以与 4T1 细胞相当的水平分泌乳酸（图 4d ）。 4T1 表达的 HK1 、 PFK1 、 PDK 和 LDHA 水平明显高于 67NR （图 4e ）。 CRMM1 和 CRMM2 植入物表现出与 4T1 参考相似的高表达水平。 4T1 、 CRMM1 和 CRMM2 在斑马鱼模型中保留了其高糖酵解特性。

总之，斑马鱼巨噬细胞依赖性血管生成与移植细胞的糖酵解特性之间的一致性表明，这些细胞在有氧糖酵解过程中分泌的乳酸可以吸引巨噬细胞并诱导其向 M2 表型极化，从而导致高水平促血管生成因子的表达和诱导斑马鱼血管生成。

为了进一步验证斑马鱼模型中观察到的 CoM 细胞代谢与巨噬细胞向促血管生成特性极化之间的转化关系，研究者利用结膜黑色素瘤细胞分泌的上清液处理人类巨噬细胞。结果显示 CoM 细胞分泌的上清液使巨噬细胞极化为 M2 样表型，并导致促血管生成因子表达增高。这些结果证明， CoM 细胞糖酵解能够使人类巨噬细胞向 M2 表型极化并增加其促血管生成能力（图 5 ）。

最后，研究者在斑马鱼体内验证了抑制糖酵解会降低人巨噬细胞中 VEGF-A 和 TGF-β 的产生。利用 2DG 抑制细胞系 4T1 、 CRMM1 和 CRMM2 的糖酵解。结果显示 2DG 处理这些细胞会阻碍新血管向这些异种移植物生长。高糖酵解细胞诱导的 VEGF-A 和 TGF-β 等促血管生成基因的高表达被 2DG 处理抑制到低糖酵解 67NR 细胞移植引起的水平。因此， 2DG 抑制移植的 CoM 细胞中的糖酵解会抑制巨噬细胞的募集和 M2 极化（图 6 ）。

这项研究有助于理解巨噬细胞和 CoM 细胞之间的相互作用，并为进一步的临床前实验奠定了基础。巨噬细胞可诱导高糖酵解的 CoM 黑色素瘤新血管生成，并且是其转移性播散的潜在机制。

该研究由莱顿大学的 Ewa Snaar-Jagalska 教授和陈泉池教授合作完成，并于 2024 年 6 月在线发表于 Angiogenesis 。

文章信息： Yin J, Forn-Cuní G, Surendran AM, Lopes-Bastos B, Pouliopoulou N, Jager MJ, Le Dévédec SE, Chen Q, Snaar-Jagalska BE. Lactate secreted by glycolytic conjunctival melanoma cells attracts and polarizes macrophages to drive angiogenesis in zebrafish xenografts. Angiogenesis. doi: 10.1007/s10456-024-09930-y