原名：
Combination transcriptomic and metabolomic reveal deterioration of the blue
honeysuckle (
Lonicera caerulea
L.) fruit and candidate genes regulating
metabolism in the post-harvest stage
译名：
转录组学和代谢组学相结合揭示了蓝靛果 （
Lonicera caerulea L.
） 果实的劣化和收获后调节代谢的候选基因
期刊：
International Journal
of Biological Macromolecules
在贮藏过程中，蓝靛果的外观品质发生了显著变化。在常温贮藏条件下，第7天时果实便出现了腐烂和发霉现象（见图1A）。随着贮藏的进行，果实逐渐失重并变软。常温贮藏14天后，果实失重率高达32.6%（见图1C）。相比之下，低温贮藏则有效降低了果实的失重率，仅为9.6%。在常温贮藏期间，果实中黄酮类物质、总酚类物质、总花青素以及氨基酸的含量均有所增加，这可能与果实明显的失重有关（见图1G、H、I、J）。然而，在整个贮藏过程中，可溶性固形物和总酸含量并未出现显著且一致的变化（见图1E、F）。在常温条件下，果实的ΔE值显著升高，果面颜色变化明显，至贮藏第14天时，ΔE值达到了14.6。而低温贮藏则有效保持了果实的颜色，贮藏期间颜色变化甚微（见图1B）。
图1 蓝靛果在常温和低温贮藏期间的变化情况。（A-B）贮藏期间果实的外观图像及色差。（C-F）贮藏期间果实的失重率、硬度、可溶性固形物含量和总酸含量。（G-J）贮藏期间果实的黄酮、总酚、总花青素和氨基酸含量。（K-N）贮藏期间果实的纤维素、半纤维素、原果胶和可溶性果胶含量。（O-R）贮藏期间（O）纤维素酶（CE）、（P）多聚半乳糖醛酸酶（PG）、（Q）果胶甲酯酶（PME）和（R）β-葡萄糖苷酶（β-glu）活性的变化。C-R中的数据为三个生物学重复的平均值。误差棒表示三个生物学重复的标准差。图中不同字母表示在相同贮藏条件下不同时间之间存在显著差异（p≤0.05）。星号表示常温和冷库贮藏之间的显著差异（无显著差异：“ns”，p≤0.05：*，p≤0.01：**和p≤0.001：***）。对于本图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本。
同时，低温有效保持了果实的硬度。在贮藏14天后，低温下果实的硬度比常温下高出1.38倍（见图1D）。果胶和纤维素含量的稳定性，以及果实半纤维素减少速率的有效延缓，均与低温条件相关（见图1K、L、M、N）。在贮藏后期，酶活性呈依次上升趋势。低温贮藏组的果胶甲酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、β-葡萄糖苷酶（β-glu）和纤维素酶（CE）活性均显著低于常温贮藏组（
p
<0.05）（见图1O、P、Q、R）。贮藏14天后，低温贮藏果实的PME、PG、β-glu和CE活性仅分别为常温贮藏果实的57.6%、66.2%、77.1%和54.9%。
在常温下收集第0天、第2天和第7天的果实，以及在低温下收集第7天和第14天的果实，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。检测到的总代谢物数量为1011种，包括47种生物碱、112种氨基酸、209种黄酮类化合物、34种木脂素与香豆素、145种脂质、59种核苷酸、61种有机酸、206种酚酸、7种单宁、18种萜类化合物以及124种其他化合物。黄酮类化合物是鉴定出的代谢物中最大的一类，约占总数的20.57%（见图2A）。对照组与常温贮藏组（RT2和RT7）之间存在显著差异，而低温贮藏组之间则无显著区别（见图2B）。每个样本中众多代谢物与对照水平（CK）相比均存在显著差异表达（见补充表S2），即RT2样本中有113种上调和33种下调，RT7样本中有151种上调和67种下调，LT7样本中有74种上调和69种下调，LT14样本中有78种上调和74种下调（见图2C、D）。此外，与相应的RT2水平相比，RT7样本中鉴定出49种上调和57种下调的代谢物（见图2C、D）。在对比组RT7vsLT7和LT7vsLT14中，分别有57种和19种上调的代谢物，以及136种和32种下调的代谢物。各对比组中脂质化合物的数量差异更为显著，尤其在对照组与低温组的对比中更为突出（见图2E）。
我们对所有对比组中鉴定出的差异积累代谢物（DAMs）进行了K-Means聚类分析。K-Means聚类分析结果显示，低温贮藏缓解了代谢物的积累趋势，且RT7与CK和LT7之间存在显著差异（见补充图S1A）。CKvsRT7和RT7vsLT7中常见DAMs的积累趋势相反，并且它们在半乳糖代谢（ko00052）中显著富集（见图2F）。同时，贮藏期间大部分DAMs也在黄酮类生物合成（ko00941）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、植物激素信号转导（ko04075）以及苯丙氨酸代谢（ko00360）中显著富集（见补充图S1B-H）。依据富集分析及对比组之间的差异，我们鉴定出24种在贮藏期间显著变化的关键代谢物。这些DAMs被分为以下三个聚类群（见图2G和补充表S3）：（Ⅰ）脂质、氨基酸及其衍生物、生物碱、酚酸和其他；（Ⅱ）有机酸（琥珀酸、甲基丙二酸和酮戊二酸）以及黄酮类化合物（柚皮素和短叶松素）；（Ⅲ）色胺、L-苹果酸、二氢槲皮素和5种糖类。Ⅰ类代谢物的丰度在贮藏期间显著增加，在常温下至第七天时观察到的倍数变化大于2，而Ⅱ类聚类群中的代谢物则呈现出相反的趋势。此外，Ⅲ类代谢物的丰度在常温下显著降低（差异倍数值≤0.5），在低温下则无显著变化。
为评估蓝靛果在贮藏过程中的果实劣变情况以及低温延缓果实衰老、维持果实品质的潜在转录调控机制，本研究基于RNA-seq数据构建了15个cDNA文库。依据log2 |Fold Change|≥1和FDR<0.05的标准，我们在CKvsLT14、CKvsLT7、CKvsRT2、CKvsRT7、LT7vsLT14、RT2vsRT7、RT7vsLT7对比组分别鉴定出13186、13105、4372、11704、683、4388、15414个差异表达基因（DEGs）（图3A）。在低温贮藏的第7天至第14天，基因表达未见明显变化，而其他对比组的基因表达差异显著。我们通过k-means聚类分析探究DEGs的潜在功能（图3B），发现低温提升了与劣变相关的下调基因水平（如子类3所示），同时抑制了与劣变相关的上调基因水平（如子类4所示）。子类3中的1305个下调基因主要参与黄酮类生物合成、柠檬酸循环、糖酵解以及花青素生物合成（图3D）。子类4中的6436个上调基因在KEGG富集分析中显著富集于氨基酸、蛋白质、核酸及次级代谢产物的生物合成途径（图3E）。
图2 蓝靛果在贮藏期间果实代谢组数据的多元统计分析。（A）代谢物分类。（B）不同样品间代谢物的主成分分析（PCA）图。（C）不同对照组的示意图。（D）每个对照组中不同代谢物的数量。（E）堆叠柱状图百分比显示了每个对照组中按不同分类划分的差异积累代谢物（DAMs）所占的比例。（F）KEGG分析了在CKvsRT7和RT7vsLT7中趋势相反的共有DAMs。（G）热图展示了贮藏期间关键DAMs的积累情况（单一数据）。
图3 转录组数据分析。（A）各对比组中的差异表达基因（DEG）数量。（B）所有DEG的K-means聚类分析。（C）CKvsRT2中DEG的Sankey点路径富集分析。右侧为基因本体（GO）富集气泡图，左侧标注了路径中的关键基因。（D）亚类3中DEG的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。（E）亚类4中DEG的KEGG富集分析。
为了探究在体外首先响应的关键基因，我们对CKvsRT2中的差异表达基因（DEGs）进行了研究。生物学过程相关术语（GO富集）主要涉及黄酮类物质的生物合成与代谢、对几丁质的响应、果实成熟、植物激素的响应与代谢以及细胞壁的发生与降解（见图3C）。在黄酮类物质合成与代谢过程中，茉莉酸诱导的氧化酶2（
JOX2
）和蛋白DOWNY MILDEW RESISTANCE 6（
DMR6
）呈现出特异性上调表达趋势，而其他关键基因（如查尔酮合成酶等）则表现为下调表达。在对几丁质的响应过程中，油菜素内酯响应的RING蛋白1（
BRH1
）、锌指蛋白ZAT10（
ZAT10
）、可能的WRKY转录因子40（
WRK40
）以及乙烯响应转录因子6（
EF103
）在RT2时表达水平上升。调控果实成熟与衰老的乙烯形成酶基因（
ACCO
）、聚半乳糖醛酸酶基因（
PGLR
）以及内切几丁质酶基因（
EP3
）在采后2天的表达水平显著增加（见表S4）。
为进一步探究贮藏期间的代谢调控机制，本研究采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对差异表达基因（DEGs）的共表达网络进行了深入分析。DEGs被划分至17个共表达模块（以不同颜色标识）（见图4A）。模块与性状关联的热图（见图4B）显示，绿色模块中的转录本积累与糖类代谢物中的d-果糖6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、棉子糖、d-葡萄糖6-磷酸以及低聚糖的积累呈正相关，而与d-山梨醇、甘露醇以及酚酸代谢物的积累呈负相关。红色模块与糖类及酚酸代谢物的关联则呈现出相反的趋势。与此同时，脂质和生物碱与红色模块呈正相关。黄色模块与有机酸和黄酮类物质代谢物呈正相关。这表明，这三个模块中的基因参与了与果实贮藏期间品质劣变相关的特定性状物质的降解与积累过程。
图4 水果贮藏期间转录组与代谢数据之间的关联。（A）不同贮藏阶段通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别的共表达模块（簇）的树状图。树枝代表17个不同颜色的模块。（B）模块 - 代谢物关系的热图。行代表模块，以不同颜色表示，列代表代谢物。红色表示正相关关系，蓝色表示负相关关系。（关于本图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版。）
图5 糖代谢和有机酸途径的假定转录代谢调控网络。（A）糖代谢组分与糖代谢相关关键基因之间的相关性网络热图（皮尔逊相关系数 >
0.80 或 < -0.80）。（C）有机酸与有机酸代谢相关关键结构基因之间的相关性网络热图（皮尔逊相关系数 > 0.70）。（B，D）糖代谢途径（B）和有机酸途径（D）中关键基因与转录因子的共表达分析。节点代表“基因”，边代表基因之间的“连接”。边的确定依据分别为皮尔逊相关系数 > 0.85 或皮尔逊相关系数 < -0.85。红色边表示与结构基因相关性最高的转录因子。不同颜色区分结构基因和转录因子家族。
图6 类黄酮和酚酸代谢途径的假定转录调控网络。（A）类黄酮组分与类黄酮途径关键基因之间的相关性网络热图（皮尔逊相关系数 >
0.70）。（C）酚酸与酚酸途径相关关键基因之间的联系网络热图（未筛选）。（B，D）类黄酮代谢途径（B）和酚酸途径（D）中关键基因与转录因子的共表达分析。节点代表“基因”，边代表基因之间的“连接”。边的确定依据分别为皮尔逊相关系数 > 0.85 或皮尔逊相关系数 < -0.85。红色边表示与基因相关性最高的转录因子。不同颜色区分基因和转录因子家族。
