中性粒细胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）是中性粒细胞在受到特定刺激时释放的一种由DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成的网状结构。oh，no！开头又是一段无聊的定义，但是当你看到NETs在国自然中的表现，你还会觉得无聊吗？在国自然竞争愈发激烈的当下，该领域内的资助力度逐年加大，自然这个热点小编也不想让大家错过。
今天就同大家来解析一下NET相关的研究应该怎么做，我们不妨先从一篇山东大学齐鲁医院等团队发表在Cellular & Molecular Immunology（IF 21.8）杂志的文章说起，看看大家能否理解其中的思路，并拿来一部分借鉴到自己的课题中去。
本研究探讨了乙醛脱氢酶2（ALDH2）（关键蛋白）在脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）（疾病模型）中的作用，发现携带ALDH2rs671突变的个体更易发展为脓毒症ARDS。进一步的发现ALDH2能够促进PAD4与E3泛素连接酶CHIP的结合，从而增加PAD4的K48多泛素化（调控通路），来调节NETs形成（关键机制）和减轻ARDS严重性。使用ALDH2特异性激活剂Alda-1（干预措施/临床转化）可显著改善脓毒症ARDS，表明ALDH2激活可能是治疗脓毒症的有效策略。
1、 本文的关键蛋白ALDH2是如何得出？
其实这个问题很好回答，作者所选用的患者就是携带ALDH2rs671突变的个体，发现他们在脓毒症中发展为ARDS的风险更高。但是有些小伙伴不服气要问了，凭什么作者就选择这个突变的个体呢？其实ALDH2rs671是一种在亚洲人群中较为常见的基因变异，特别是在东亚人群中。这种变异导致ALDH2酶活性显著降低，从而可能影响个体对某些疾病的易感性。此外，ALDH2是一种重要的酶，参与清除体内有毒醛类物质，如乙醛。ALDH2的活性与多种疾病的发生发展有关，包括心血管疾病、神经退行性疾病和某些类型的癌症。所以作者才回去考虑说，是否能将ALDH2rs671突变的个体与脓毒症结合起来。
2、作者是如何将ARDS同本文的机制NETs相联系起来的？
作者发现这些患者的血液中无细胞DNA (cfDNA) 和髓过氧化物酶 (MPO) - DNA复合物的水平更高，这些是NETs)的关键生物标志物。使用Aldh2-/-和Aldh2rs671基因敲入小鼠模型，研究者在脓毒症相关模型中观察到这些小鼠表现出更严重的肺部和循环中的NETosis。（这里的验证，作者从临床走向动物模型验证，逻辑还是很紧凑的）
3、作者是如何发现PAD4的，又是如何验证ALDH2对PAD4作用的？
其实，早已有研究报道PAD4通过其酶活性催化组蛋白的瓜氨酸化，这是NETosis发生的关键步骤。因此，研究者假设ALDH2可能通过影响PAD4的稳定性来调节NETosis。免疫共沉淀（Co-IP）实验，也证实了ALDH2能够促进PAD4与E3泛素连接酶CHIP的结合，从而增加PAD4的K48多泛素化，导致PAD4通过泛素-蛋白酶途径的降解。在Aldh2-/-和Aldh2rs671基因敲入小鼠模型中也观察到PAD4蛋白水平的增加，以及NETosis的增强，这与ALDH2缺失或功能降低相关。进一步通过过表达ALDH2或使用ALDH2激活剂Alda-1处理，研究者观察到PAD4蛋白水平的降低和NETosis的抑制。
4、作者最后是如何回归临床，让研究变得更具临床转化价值的？使用ALDH2特异性激活剂Alda-1在动物模型中进行干预实验，发现Alda-1能够显著改善脓毒症引起的ARDS症状，这为临床治疗提供了潜在的药物候选。这一发现揭示了ALDH2通过促进PAD4的多泛素化和降解来抑制NETosis的分子机制，这为开发针对特定分子靶点的药物提供了理论基础。
使用Aldh2-/-和Aldh2rs671基因敲入小鼠模型来研究ALDH2在脓毒症引起的ARDS中的作用。
利用Co-IP和Western blot研究ALDH2与PAD4及CHIP之间的相互作用及其对PAD4蛋白稳定性的影响。
使用免疫荧光和免疫组织化学检测和定位肺组织中的NETs标志物，如瓜氨酸化的组蛋白H3（H3Cit）。
- 利用表面等离子共振（SPR）研究ALDH2与CHIP之间的直接相互作用。
1、为亚洲人群易发突变ALDH2rs671添加新的机制解释
研究发现携带ALDH2rs671突变的个体更容易发展为脓毒症ARDS，这强调了ALDH2在疾病易感性中的作用。通过使用ALDH2特异性激活剂Alda-1，研究者能够显著改善脓毒症小鼠模型中的ARDS症状，这为开发新的治疗策略提供了潜在的药物靶点。
2、为NETosis过程中的关键蛋白PAD4调控添新机制
研究者发现ALDH2通过促进PAD4与E3泛素连接酶CHIP的结合，增加PAD4的K48多泛素化和降解，从而抑制NETosis。这一发现揭示了ALDH2在调控NETs形成中的分子机制，为理解ALDH2在炎症和免疫反应中的功能提供了新的视角。其实，有关NET的研究近些年越发得到大家的重视，同样的在和大家分享一篇讲述有关NET的文章。
这篇文章中，作者首先发现IGF2BP3在胶质瘤中的表达与浸润性中性粒细胞的增多有显著的正相关性，通过体外共培养模型，作者观察到胶质瘤细胞与中性粒细胞共培养时，能够诱导中性粒细胞形成NETs。进一步的实验显示，IGF2BP3的过表达可以增强胶质瘤细胞诱导的NETs形成，而IGF2BP3的敲低则减少了NETs的形成。（通过关注中性粒细胞引出NETs，而上文是通过在血液中检测到NETs关键的生物标志物引出的，可以说是有异曲同工之妙）
随后，作者通过mRNA测序和蛋白质组学分析，发现IGF2BP3（关键分子）通过m6A修饰影响CSF3（集落刺激因子3）的表达，进而调控NETs的形成。通过使用CSF3的中和抗体或重组蛋白（上文用的是激活剂，而这里选择的是抑制剂/抗体），作者验证了CSF3在IGF2BP3诱导的NETs形成中的作用。在体外实验中，作者通过免疫荧光染色和电子显微镜观察到IGF2BP3诱导的NETs形成。在体内实验中，通过在小鼠模型中敲低IGF2BP3或给予BET抑制剂（能够抑制IGF2BP3表达），作者观察到肿瘤生长的抑制和NETs形成的减少。
本文结果揭示了IGF2BP3在NETs形成中的作用，还展示了靶向NETs可能成为一种克服溶瘤病毒治疗抵抗的策略
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