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“内卷严重”，看重庆医科大学郭风劲团队用国自然新贵——细胞衰老联合干湿结合如何出圈，思考简单到哭~

生信图书馆 · 公众号 · · 2024-08-07 19:00

正文

最新的5.9分非肿瘤生信推荐给大家啦~馆长发现此类生信文章近期很盛行呐!因为门槛比较低，发文比较容易，性价比高。关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型：通过单个疾病WGCNA分析筛选关键基因，或者通过热点基因集/机器学习算法来识别关键基因，或者通过转录组生信分析。

今天馆长要分享的内容是利用热点基因集（衰老相关数据集）来识别骨关节炎（OA）的关键基因，研究思路非常简单，但影响因子高达5.9分。这篇研究使用强有力的湿实验验证关键基因与OA之间的作用机制，为OA的靶向治疗分子提供了研究基础。 PS：馆长还有很多最新的国自然热点生信文章，扫码与馆长联系哦~免费的生信福利送给大家！

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题目：靶向衰老相关基因MAPK12和FOS缓解骨关节炎

杂志：Journal of Orthopaedic Translation

影响因子：IF=5.9

发表时间：2024年7月

公众号回复“666”二字可以领取本文献，文献编号：240807

研究背景

骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，是导致残疾和社会经济负担的主要原因，早期预防和治疗骨性关节炎显得尤为重要。越来越多的证据表明，延缓骨性关节炎关节软骨的衰老是一种非常有效的治疗方法。细胞衰老是一种应激反应，可导致细胞周期的永久停止。低水平炎症在OA的发生发展中起着重要作用，而且衰老和炎症之间也存在联系。本研究通过对OA数据集与人类衰老基因数据库的交叉分析，鉴定出了4个与OA患者衰老相关（SASP）的关键基因。并且进一步证实了MAPK12和FOS可能通过调节体内外细胞衰老参与了OA的发生发展。本研究为了解OA的衰老和病因，以及SASP作为潜在的靶向治疗分子提供了研究基础。

研究思路

基于遗传操作实验的骨关节炎数据集GSE82107与基于基因表达谱蛋白的人类衰老相关基因数据库的衰老数据集进行交叉，筛选出4个重叠关键基因。通过qRT-PCR在体外和人OA软骨组织中分别验证了关键基因。随后通过qRT-PCR、蛋白印迹、Edu染色、免疫荧光、SA-β-gal染色、HE、IHC、Von Frey测痛试验和热板测痛仪进一步证实了丝裂原活化蛋白激酶12（MAPK12）和Fos原癌基因（FOS）在体内外的作用。

研究结果

1. 骨关节炎中衰老特异性DEGs的鉴定

对GSE82107数据集中的样本进行分析，获得1676个DEGs，其中包括218个上调基因和1458个下调基因（图1A, 1B），结果显示OA患者SASP相关基因IL6、IL-1β和MMP13表达上调。图1C, 1D显示了GO富集和KEGG分析。将GSE82107数据集与细胞年龄数据库相交后，OA和衰老基因中均出现4个差异表达基因，包括3个上调基因CYR61、FOS、TNFSF15和1个下调基因MAPK12（图1A-E）。通过STRING工具分析了MAPK12或FOS与细胞增殖、衰老、软骨合成代谢和分解代谢相关蛋白之间的相互作用(图1F)，结果表明MAPK12或FOS可能通过CDKN2A (p16)、CDK2、CCND1 (CyclinD1)、IL6、IL-1β、TNFα和MMP13与细胞衰老和SASP相关。

图1：骨关节炎的DEG鉴定和衰老特异性关键基因筛选

2. 骨关节炎中衰老特异性基因表达的验证

根据OA与衰老的数据库分析，选择了MAPK12、FOS、CYR61、TNFSF15四个表达差异显著的蛋白，测量了它们在OA中的表达水平。6个人骨关节炎病变和非病变软骨组织的qRT-PCR和免疫组化染色结果显示，与非病变对照组织相比，OA病变软骨中FOS、CYR61和TNFSF15 mRNA或蛋白水平下调，MAPK12 mRNA或蛋白水平上调(图2A和B)。此外，在关节软骨中也观察到类似的结果。随后，建立了H ₂ O ₂ 诱导的软骨细胞衰老和IL-1β刺激的OA模型。结果表明，在H ₂ O ₂ 刺激的C28/I2细胞中，SA-β-gal水平、p16、p21、FOS、CYR61和TNFSF15的表达再次显著上调，而MAPK12的表达明显下调(图2C和D)。

图2：骨关节炎中候选衰老特异性基因mRNA和蛋白水平的验证

3.MAPK12过表达可抑制过氧化氢诱导的衰老和DNA损伤

与对照细胞相比，过表达MAPK12可增加H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞中增殖相关基因CDK2、CDK4、CDK6、CyclinA1、CyclinD1、CyclinE1、LMNB1、PCNA的表达和细胞增殖率(图3A, 3B)。此外，与对照细胞相比，过表达MAPK12可以降低衰老和SASP基因的表达，包括p16、p21、分解代谢相关基因MMP13。DNA损伤标志物γ-H2AX在H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞中表达上调， MAPK12过表达可再次显著抑制DNA损伤标志物γ-H2AX的表达(图3C)。SA-β-gal染色表明， MAPK12过表达可以明显缓解H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞的衰老和SASP(图3D)。这表明MAPK12抑制H2O2诱导的衰老和DNA损伤。

图3：MAPK12过表达抑制H2O2诱导的C28/I2细胞衰老和DNA损伤

4.MAPK12过表达促进软骨合成代谢和增殖，抑制IL- 1β刺激的软骨分解代谢和衰老

在IL-1β刺激的C28/I2细胞或小鼠原代软骨细胞模拟的体外OA微环境中，过表达MAPK12可增加IL-1β诱导的软骨细胞中增殖相关基因、降低衰老和SASP基因p16、p21、IL6、TNFα的表达。此外，过表达MAPK12可增强软骨合成代谢基因COL2、ACAN、SOX9的表达，降低IL-1β刺激的软骨细胞中软骨分解代谢基因MMP13、ADAMTS5的表达（图4A，4B）。此外，EdU检测结果也显示，在IL-1β刺激的C28/I2细胞中，过表达MAPK12显著促进了细胞增殖（图4C和D）。

图4：MAPK12的过表达促进IL-1β刺激的C28/I2细胞的软骨合成代谢和增殖，抑制软骨分解代谢和衰老

5.FOS缺乏可抑制过氧化氢诱导的衰老和DNA损伤

敲除FOS可增加H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞中增殖相关基因的表达，而降低p16、p21、MMP13的表达的表达（图5A）。此外，EdU检测还显示，敲除FOS可以显著促进H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞的增殖（图5B）。此外，在H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞中，γ-H2AX表达表达上调，而FOS表达下调可明显抑制其表达（图5C）。SA-β-gal染色显示，敲除FOS可以明显缓解H ₂ O ₂ 诱导的C28/I2细胞的衰老（图5D）。

图5：FOS敲除抑制H2O2诱导的C28/I2细胞衰老和DNA损伤

6.FOS缺乏促进软骨合成代谢和增殖，抑制IL-1β刺激的软骨分解代谢和衰老

作者还在体外检测了FOS在IL-1β刺激的C28/I2细胞或小鼠原代软骨细胞模拟OA微环境中的作用，结果显示，敲除FOS可提高IL-1β诱导的软骨细胞中增殖相关基因的表达，降低p16、p21、p21、IL6、TNFα的表达。此外，FOS敲低可增加IL-1β刺激的软骨细胞中COL2、ACAN、SOX9的表达，并降低MMP13的表达（图6A、B）。EdU实验结果还显示，在IL-1β刺激的C28/I2细胞中，下调FOS明显促进了细胞增殖（图6C和D）。

图6：FOS敲除抑制H2O2诱导的C28/I2细胞衰老和DNA损伤

7.MAPK12过表达和FOS缺失抑制DMM小鼠软骨细胞衰老，缓解骨关节炎和关节疼痛

使用8周大的野生型雄性C57BL/6J小鼠在体内建立DMM模型，将过表达的腺病毒MAPK12（OE-MAPK12）或siFOS注射到膝盖腔。HE和Safranine O结果显示，oe对照组和si对照组小鼠关节软骨退变、半月板病变和滑膜增生增加，而OE-MAPK12和siFOS有效减缓了软骨损伤、半月板损伤和滑膜炎(图7A)，通过分析国际骨关节炎研究协会(OARSI)、半月板总分和滑膜炎评分进一步验证了这一结论(图7B)。此外，与oe对照组和si对照组相比，添加MAPK12或缺乏FOS恢复了DMM手术诱导的软骨合成代谢的抑制和分解代谢的促进，OE-MAPK12和siFOS组Col2、ACAN升高，MMP13、Adamts5表达降低(图7C和D)。同时，Von frey试验(图7E)和热板测痛仪 (图7F)结果显示，在DMM手术后6周和8周，OE-MAPK12和siFOS小鼠的关节疼痛得到了很大程度的缓解。OE-MAPK12和siFOS小鼠关节软骨组织中衰老相关标志物p16、p21、γ-H2AX和IL6的表达降低，显示了OA中MAPK12过表达和FOS缺乏的抗衰老作用(图8A、B、C、D、E)。综合这些结果表明, MAPK12和FOS在软骨细胞衰老和骨关节炎的发生和进展中发挥重要作用。

图7：MAPK12过表达和FOS缺乏可减轻OA患者的骨关节炎和关节疼痛

文章小结

本研究探讨了MAPK12和FOS通过调节软骨细胞衰老参与OA的发生发展，发现MAPK12和FOS可以通过调节软骨细胞衰老来有效缓解OA，从而为未来预防或治疗OA提供了潜在的治疗靶点。这篇研究思路非常简单，但用了一个角度新颖的热点（细胞衰老）去研究与OA的关系，结果抓人眼球！还有一个高分秘籍，那就是用了大量的湿实验去验证结果，使得生信内容更加可靠。如果大家想要研究某一疾病的关键基因作用机理，那么这篇文章的研究思路非常适合你！关注馆长，这里你要的全都有！

馆长有话说

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