【高分综述 044】免疫检查点抑制剂的生物标志物：进展与展望

• 免疫检查点抑制剂（ICI）作为重要的癌症治疗手段，通过激活T细胞来对抗肿瘤。ICI主要针对的免疫检查点分子包括CTLA-4、PD-1、LAG-3以及癌细胞和抗原呈递细胞上的PD-L1。

• 自2011年抗CTLA-4抗体ipilimumab获批以来，已有多种抗PD-1、抗PD-L1和抗LAG-3抗体获得FDA批准。

• PD-1/PD-L1抑制剂是当前临床上主要使用的ICI，但并非所有患者均能从中受益，且可能引起免疫相关不良事件（irAE）。

• 能够区分治疗过后能否对疾病有所缓解以及预测可能发生严重副作用的患者的生物标志物至关重要。

当前使用的生物标志物及其挑战

PD-L1表达：

• PD-L1是抗PD-1/PD-L1治疗在多种癌症中的关键生物标志物。免疫组化(IHC)染色是评估患者PD-L1表达的主要方法。

• FDA和EMA已经批准了四种PD-L1 IHC抗体：SP142、22C3、28-8和SP263，以及它们在两个特定制造商平台上的染色协议，作为伴随诊断。

• SP142用于阿特珠单抗治疗尿路上皮癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和三阴性乳腺癌(TNBC)。

• SP263用于杜瓦利单抗治疗NSCLC和尿路上皮癌，以及西米普利单抗或阿特珠单抗治疗NSCLC。

• 28-8用于纳武利单抗联合伊匹单抗治疗NSCLC。

• 22C3用于帕博利珠单抗治疗多种癌症，包括NSCLC、头颈鳞状细胞癌、宫颈癌、TNBC、胃或胃食管交界处腺癌、食管鳞状细胞癌和尿路上皮癌，以及西米普利单抗治疗NSCLC。

• PD-L1染色的评分包括基于细胞类型、位置、频率和PD-L1表达强度的算法，临床设置中使用了三种评分算法：TPS（肿瘤比例分数）、CPS（综合阳性分数）和IC（免疫细胞）。

• PD-L1染色的多样性和复杂性可能影响诊断的准确性和治疗决策。肿瘤内部和之间的PD-L1表达异质性，以及治疗如化疗可能导致的PD-L1表达变化，增加了其作为生物标志物的复杂性。

PD-L1的糖基化作为导致PD-L1假阴性检测的一个混杂因素：

• PD-L1的糖基化是其细胞外结构域的一种翻译后修饰，显著调节其稳定性和与免疫系统的相互作用。

• 糖基化不仅影响PD-L1的生物学功能，也使得在肿瘤组织中，特别是使用传统的IHC染色协议时，PD-L1的检测变得复杂。

• 由于PD-L1糖基化导致的屏蔽效应，某些检测抗体可能难以识别PD-L1表位，导致IHC染色中PD-L1反应减弱或阴性。这可能剥夺患者接受有效ICI治疗的机会。

• 为解决这一挑战，学者们开发了一种改进的染色协议，包括在IHC染色前去除糖基化的预处理步骤。这种新方法在多种癌症类型中提高了PD-L1的检测成功率，并且与患者对ICI治疗的反应之间呈现出更强的相关性。

• 尽管去糖基化对PD-L1诊断染色的影响仍在讨论中，但研究报告显示它对染色强度和特异性的影响各不相同。

• 这些差异突显了抗体与PD-L1相互作用的复杂性，并强调了继续研究以完全理解PD-L1糖基化对癌症诊断和治疗影响的必要性。

PD-L1染色的其他潜在干扰因素：

• PD-L1表达在肿瘤内部（intratumoral heterogeneity）和不同肿瘤之间（intertumoral heterogeneity）存在显著差异，这可能导致采样误差，尤其是当活检不能准确代表肿瘤整体的PD-L1状态时。

• PD-L1表达不仅在不同肿瘤区域和不同时间点表现出异质性，而且可能因肿瘤进展和治疗（如化疗）而随时间变化。

• 某些行为和遗传因素，如吸烟习惯和KRAS突变，与肺癌中PD-L1表达显著相关，这强调了这些因素在肺癌免疫环境中的重要性。

• 使用不同抗体进行染色时存在的技术问题，包括抗体在PD-L1的细胞外或细胞内结构域的表位差异、染色协议的差异，以及对PD-L1阳性表达的解释差异，增加了PD-L1染色的复杂性。

• PD-L1表达的动态性可以受到肿瘤微环境的影响，包括炎症细胞因子在转录、翻译和翻译后水平的调节作用。

肿瘤突变负荷（TMB）：

• TMB是衡量癌细胞基因组中遗传突变数量的指标，反映了由环境和细胞内因素诱导的突变过程。TMB与新抗原的存在有关，这些新抗原可能被免疫系统识别，从而增加T细胞清除肿瘤细胞的可能性。

• TMB的测量最初通过全外显子测序(WES)进行，包括编码区的非同义突变，并排除了与正常样本相比的遗传变异。然而，WES的成本较高，技术要求复杂，限制了其在临床上的广泛应用。

• FDA已经批准了几种用于测量TMB的检测方法，包括FoundationOne CDx、MSK-IMPACT、Guardant360 CDx和FoundationOne Liquid CDx。

• FoundationOne CDx (F1CDx)：由Foundation Medicine开发，是一种全面的基因组分析检测，涵盖324个癌症相关基因，相当于1.1Mb的编码基因组，适用于所有实体瘤。F1CDx最近获得了FDA的批准，作为pembrolizumab治疗所有实体瘤患者的伴随诊断，这些患者的TMB为R10个突变/Mb。

• MSK-IMPACT：由Memorial Sloan Kettering癌症中心开发，可以识别468个癌症相关基因中的体细胞外显子突变，覆盖大约1.2Mb。

• Guardant360 CDx：由Guardant Health开发，是一种针对血液中循环无细胞DNA(cfDNA)的下一代测序(NGS)液体活检测试，专门设计用于识别55个临床上相关的基因突变。

• FoundationOne Liquid CDx (F1 Liquid CDx)：是一种定性的基于NGS的体外诊断测试，为晚期实体瘤患者设计，使用cfDNA分析324个基因。

微卫星高度不稳定/错配修复缺陷 （MSI-H/dMMR）：

• 微卫星是含有1-6个核苷酸的重复DNA序列，遍布整个基因组。正常情况下，DNA的完整性和微卫星的长度由DNA错配修复（MMR）系统维持，该系统纠正DNA聚合酶在复制过程中产生的碱基错配或由DNA损伤引起的错配。在存在dMMR的情况下，微卫星长度的变化导致微卫星不稳定（MSI）。

• MSI-H和/或dMMR的肿瘤由于DNA修复机制的缺陷，导致突变的大量积累，使肿瘤细胞更容易被免疫系统识别。这一特性使MSI-H/dMMR成为预测ICI反应的潜在生物标志物。

• 2022年，FDA批准了F1CDx作为伴随诊断，用于识别MSI-H实体瘤患者。这有助于识别可能从pembrolizumab治疗中受益的个体。

• F1CDx使用基于分数的（FB）MSI算法，通过全基因组分析2000多个微卫星位点来分类肿瘤标本为MSI-H或微卫星稳定。FB-MSI分数0.0124或更高的实体瘤被报告为MSI-H。

• Pembrolizumab是首个获得FDA批准用于预处理MSI-H结直肠癌的ICI，后来也用于一线MSI-H结直肠癌治疗。Dostarlimab获得了FDA对预处理MSI-H子宫内膜癌和实体瘤的加速批准，并在2023年获得了MSI-H子宫内膜癌一线治疗的完全批准。

目前正在研究的ICIs的

潜在生物标志物

与DNA损伤/抗原呈递/干扰素信号相关的潜在生物标志物：

• DNA损伤响应(DDR)涉及多种修复途径，包括错配修复、直接逆转、碱基切除修复、核苷酸切除修复、同源重组修复和非同源末端连接。DDR基因的变异与提高的肿瘤突变负荷(TMB)和微卫星高度不稳定(MSI-H)有关，并且与对PD-1/PD-L1治疗的反应相关。

• MHC-I分子在细胞表面呈递细胞内蛋白，对T细胞识别异物或突变肽至关重要。MHC-I的肽结合亲和力是影响抗原性的关键因素，主要由位于染色体6上的人类白细胞抗原(HLA)位点的三个基因决定：HLA-A、HLA-B和HLA-C。MHC-I的基因和蛋白表现出高度多态性，这导致个体间在呈递突变驱动的新抗原效率上存在显著变异性。研究表明，MHC-I可能作为预测对ICI反应的一个因素。

• B2M是MHC-I的一个亚单位，对肿瘤抗原呈递至关重要。B2M缺陷可以阻碍MHC-I的抗原呈递，促进癌症免疫逃逸。

• POLE基因编码DNA聚合酶ε的催化亚单位，参与DNA复制和修复。影响其外切酶结构域的突变会导致错误校正功能的损害，从而积累突变。

• 干扰素-γ (IFN-γ) 是由活化的T细胞产生的细胞因子，对清除异常和肿瘤细胞至关重要。IFN-γ反应途径的富集表达与对免疫疗法的有利反应相关。相反，IFN-γ反应途径的失活，如JAK1/2失活突变或PSMB8启动子的高甲基化，会导致对pembrolizumab的原发性抗性。

• 与MHC-I分子不同，MHC-II分子通常特异表达在抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞和巨噬细胞。某些肿瘤类型中HLA-DR的异常表达与癌症中的有利预后和增强的ICI反应相关。

肿瘤浸润性T细胞和外周T细胞：

• 特别是肿瘤反应性的细胞毒性CD8+ T细胞，与多种肿瘤类型的临床结果改善相关。这些细胞与ICIs的有效性密切相关，依赖于肿瘤反应性细胞毒性CD8+ T细胞的持续激活和增殖。

• 基于它们的分化状态，CD8+ T细胞被广泛分类为naive T细胞、effector T细胞、memory T细胞和exhausted T细胞。单细胞RNA测序和T细胞受体(TCR)测序技术进一步细分了这些群体。

• 最近在多种组织中发现了CD103+CD69+的TRM群体，它们在循环之外，并且在肿瘤中的存在与NSCLC和口腔癌患者治疗后改善的结果相关。

• 长期抗原刺激后，肿瘤反应性细胞毒性CD8+ T细胞成为终末耗竭的T细胞。这些细胞的特点是免疫抑制受体PD-1、CTLA-4和TIM-3的表达增加。

• TPEX细胞作为耗竭T细胞的前体，在黑色素瘤患者中，对anti-PD-1治疗反应持续时间更长的与TPEX细胞的高比例相关。在NSCLC患者中，接受anti-PD-1抗体治疗的响应肿瘤中TPEX细胞也有所增加。

• 肿瘤内的三级淋巴结构(TLS)由T细胞和B细胞组成，可能作为生物标志物。在STS患者中，与PD-1/PD-L1阻断剂治疗反应改善相关的是B细胞滤泡、滤泡树突细胞和CD4+及CD8+ T细胞形成的TLS。

肠道微生物组：

• 肠道微生物组是存在于人类消化系统中的微生物群落，对人类健康和疾病有重要影响，包括营养素吸收、免疫系统调节和维持消化道内对病原体的抵抗力。

• 肠道微生物组与多种疾病有关，例如肥胖、糖尿病、自身免疫疾病和癌症。

• 研究表明，肠道微生物组的多样性与黑色素瘤患者对anti-PD-1治疗的更好反应有关，但更大患者群体的研究和几个元分析并未确认这种关联。

• 一些研究提出，在某些恶性肿瘤中，特定的微生物物种与对ICI治疗的更好反应相关。例如，在晚期黑色素瘤患者中，与对anti-PD-1和/或anti-CTLA-4治疗良好反应最突出的细菌物种包括双歧杆菌科、Coriobacteriaceae科、Ruminococcaceae科和Lachnospiraceae科。

• 尽管许多研究表明肠道微生物组在对ICIs的反应中起着关键作用，但它尚未被确立为生物标志物。未来的临床应用需要更精确地识别细菌物种/群体及其对ICI治疗产生有益和有害影响的作用机制。

• 除了将肠道微生物组作为生物标志物外，还在研究靶向微生物组的策略，以增加ICI的疗效或减少副作用。例如，来自对anti-PD-1治疗有反应的患者的粪便微生物群移植(FMT)的临床试验表明，FMT可能克服抗性并减少irAE。

其他免疫检查点：

• 除了已知的PD-1、CTLA-4和LAG-3外，其他共抑制受体如TIM-3和TIGIT的上调，以及它们的配体可能作为对ICI产生抗性的补偿机制，表明需要新的治疗剂和针对这些受体的患者分层。

• LAG-3在肿瘤浸润的CD8+ T细胞、调节性T细胞(Treg)、浆细胞样树突细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞中表达，并与包括MHC类II在内的多种配体结合。LAG-3与PD-1的共表达与癌症中的T细胞耗竭/功能障碍有关。LAG-3阻断已被证明与抗PD-1治疗协同作用，改善了抗肿瘤免疫反应并减少了肿瘤负担。

• 已有超过20种针对LAG-3的制剂在临床试验中进行了评估。例如，relatlimab（首个在临床上测试的抗LAG-3抗体）与nivolumab联合使用，在先前接受过抗PD-1/PD-L1治疗的黑色素瘤患者中提高了ORR。

• TIM-3在多种细胞上表达，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Treg、NK细胞、髓系细胞和肿瘤细胞。TIM-3与其配体之一的galectin-9 (Gal-9)结合，诱导T细胞死亡，而Gal-9在肿瘤细胞中由I型干扰素诱导表达。

• TIM-3阻断在弥漫性内脑桥胶质瘤(DIPG)中显示出强大的抗肿瘤活性，这使得TIM-3成为DIPG患者治疗中一个有吸引力的靶点。此外，Gal-9在这些患者中的表达非常高，而其他TIM-3配体几乎检测不到。

• TIGIT是CD28蛋白家族的成员，在激活的CD8+ T细胞、Foxp3+ Treg和NK细胞上表达，并与五个配体结合，包括CD112、CD113、CD155、Nectin4和Fab2。TIGIT的表达在TCR激活后增加，与CD226竞争CD155，破坏了类似于CD28-CTLA-4轴的成本刺激信号。

• 尽管抗TIGIT抗体在多项癌症类型的临床试验中显示出初步的抗肿瘤活性，但改善效果并不像最初结果所建议的那样令人印象深刻。然而，TIGIT仍是一个重要的靶点，需要生物标志物来评估治疗的疗效和选择患者。

• 鉴于基于肿瘤组织的生物标志物的限制，如获取活检的困难和肿瘤内的空间异质性，某些血浆生物标志物被认为是更容易在临床上实施的。循环肿瘤DNA (ctDNA)、中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)和可溶性形式的免疫检查点和共刺激分子已在癌症患者的血液中被检测到。

其他潜在的血浆生物标志物：

• 循环肿瘤DNA (ctDNA)是肿瘤细胞释放到血液中的小片段DNA，包含诸如突变、甲基化、微卫星不稳定性等肿瘤相关的基因组信息。ctDNA被视为液体活检的新兴生物标志物，用于癌症的初步诊断和治疗指导。FDA已批准Guardant360 CDx和F1 Liquid CDx测试，这些测试设计用于使用ctDNA检测NSCLC中的各种突变。

• 中性粒细胞与淋巴细胞比率 (NLR)是外周血中中性粒细胞与淋巴细胞计数的比率，已被证明与多种癌症类型的患者总生存期(OS)相关。最近的研究表明，NLR也与抗PD-1/PD-L1治疗的预后相关。

• 在小规模黑色素瘤患者队列的回顾性分析中，较高的可溶性CTLA-4水平与接受ipilimumab治疗的患者的响应和改善生存相关，表明可溶性CTLA-4也可能作为生物标志物。

• 血浆中的可溶性免疫检查点和共刺激分子，如可溶性PD-L1 (sPD-L1)，由于内源性基质金属蛋白酶的切割作用，从膜结合型PD-L1产生。sPD-L1被发现能够抑制T细胞活性，有助于肿瘤逃避免疫监视。在ICI治疗的不同阶段对sPD-L1血清水平的详细检查显示，sPD-L1水平的升高与较差的OS率显著相关。

• 由于获取活检的困难和肿瘤内的空间异质性，基于肿瘤组织的生物标志物存在局限性，这使得血浆生物标志物在临床上更容易实施。