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【分析】青岛科大罗细亮/徐升豪NL：可编程DNA纳米开关调节的等离子体CRISPR-Cas12a用于核酸和非核酸生物标志物分析

X-MOL资讯 · 公众号 · · 2025-02-05 08:09

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快速准确地检测临床样本中的多重生物标志物对于提高疾病诊断、预测的准确性和可靠性至关重要。得益于可编程性以及直接检测核酸和非核酸靶标的能力，CRISPR-Cas12a系统被认为是一种通用且强大的多重生物标志物分析技术，通过crRNA与“启动子”核酸序列（ssDNA或dsDNA）的杂交激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性，然后无差别的切割单链（ssDNA）报告子，根据报告子被切割后产生的信号变化便可实现对目标物的检测。尽管基于CRISPR-Cas12a的传感体系已经运用到了多重生物标志物检测，但仍面临两个不可忽视的瓶颈：（1）检测多种不同的生物标志物需要多种crRNA，增加了探针设计的复杂性和成本；（2）传统ssDNA报告子之间的随机碰撞导致切割反应动力学速率低，稳定性差以及荧光染料的光漂白等问题都会导致检测灵敏度不足，限制了其在复杂生物样品中的应用。因此，开发一种仅使用一种crRNA且具有高灵敏和高稳定性的CRISPR-Cas12a传感体系用于多重生物标志物检测具有重要意义。

针对上述科学问题， 青岛科技大学罗细亮、徐升豪 课题组基于前期等离子体激元共振增强荧光（PEF）的高灵敏精准分子检测工作的基础上（ Chem. Sci. 2024 , 15 , 566-572; Anal. Chem. 2024 , 96 , 16971–16977; Anal. Chem. 2024 , 96 , 4402-4409; Anal. Chem . 2023 , 95 , 3525-3531; Anal. Chem. 2022 , 94 , 5399-5405; Anal. Chem . 2022 , 94 , 16887-16893; Anal. Chem. 2022 , 94 , 14467-14474; Anal. Chem. 2021 , 93 , 2480-2489），开发了一种基于可编程DNA纳米开关（NS）调控的等离子体CRISPR-Cas12a金纳米星（Au-NST）报告平台，并且在空间限制效应的辅助下实现了核酸和非核酸生物标志物的检测。如图1所示，设计的可编程NS主要包括两个功能区：目标识别序列区（红色）和CHA反应触发序列区（蓝色）。通过改变识别序列（核酸靶标的互补序列和非核酸靶标的适配体序列），核酸和非核酸靶标（如miRNA-375和PSA）都可以打开NS以暴露CHA的触发序列，使CHA释放相同激活器（双链DNA）从而激活Cas12a的反式切割活性。也就是说，NS的这种设计允许使用同一种crRNA与由核酸和非核酸靶标产生的相同激活器（双链DNA）结合，达到了使用同一种crRNA实现两种不同类型目标物检测的目的。此外，为了提高检测灵敏度和增强反应动力学，通过在包覆二氧化硅的金纳米星表面修饰ssDNA报告子（用Cy5.5和BHQ-3标记）制备了金纳米星（Au-NST）报告子。得益于Au-NST报告子的空间限域效应和PEF效应，Au NSTs报告子较传统ssDNA报告子具有增强的反应动力学（反应时间缩短）和更高的灵敏度。

图1. 可编程DNA纳米开关调控的等离子体CRISPR-Cas12a平台在空间限制效应辅助下实现多重生物标志物分析的示意图。图片来源： Nano Lett.

通过改变NS的识别区域序列，核酸（miRNA-375）和非核酸目标物（PSA）均能打开NS使其暴露出相同的CHA触发序列，经过CHA反应后释放出相同的激活器（双链DNA）并激活Cas12a，泳道6中报告子条带的消失以及荧光的恢复均证明了Cas12a被激活并切割了报告子，证明了该设计仅需要改变NS的识别区域序列，便可利用一种crRNA实现两种不同类型目标物的检测（图2）。

图2. 不同类型目标物均能释放相同激活器并激活Cas12a的电泳和荧光表征。图片来源： Nano Lett.

考虑到荧光染料的光漂白导致的灵敏度不足问题以及CRISPR-Cas 12a与传统ssDNA报告子之间随机碰撞导致的切割反应动力学速率低、稳定性差等问题，作者制备了具有20个对称“热点”的金纳米星（Au NST）并选择其作为空间限制效应和PEF基底，制备了Au NST报告子（图3）。与传统ssDNA报告子相比，Au NST报告子具有更快的反应动力学，反应时间从35 min缩短至15 min，荧光强度提高了近21.5倍。此外，由于球形核酸设计，Au NST报告子对核酸酶（如DNase I）以及FBS的抗降解能力也得到了提升（图4）。

图3. 金纳米星的透射电镜、扫描电镜等表征以及金纳米星报告子的红外光谱、Zata电位、吸收光谱及DLS表征。图片来源： Nano Lett.

图4. 金纳米星报告子与传统ssDNA报告子的反应动力学及稳定性对比。图片来源： Nano Lett.

鉴于开发的NS调控CRISPR-Cas12a/Au-NSTs报告子具有出色的稳定性和检测性能，通过简单地改变NS的识别序列，进一步评估了其对临床尿液样本中miRNA-375和PSA分析的实际检测性能（图5）。实验结果表明，该策略能够实现尿液中miRNA-375和PSA的高灵敏精准定量检测，并能基于检测到的这两种尿液生物标志物的差异表达水平成功鉴别健康人和前列腺癌病人，显示了其在临床应用中的重要潜力。

图5. 可编程DNA纳米开关调控的等离子体CRISPR-Cas12a平台对尿液中miRNA-375和PSA的检测结果分析。图片来源： Nano Lett.

该研究成果近期发表在 Nano Letters 上，文章的第一作者是2022级硕士研究生 王从凯 ，通讯作者是青岛科技大学 徐升豪 副教授和 罗细亮 教授。该研究得到国家自然科学基金（21505081、22374085)）、山东省自然科学基金面上项目（ZR2023MB110）的资助支持。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Programmable DNA nanoswitch-regulated plasmonic CRISPR/Cas12a-gold nanostars reporter platform for nucleic acid and non-nucleic acid biomarkers analysis assisted by spatial confinement effect

Congkai Wang, Xiaohan Xu, Wang Yao, Lei Wang, Xiaozhe Pang, Shenghao Xu,* and Xiliang Luo*

【分析】青岛科大罗细亮/徐升豪NL：可编程DNA纳米开关调节的等离子体CRISPR-Cas12a用于核酸和非核酸生物标志物分析

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