小小的microRNA（miRNA）在近年来受到了越来越多的关注，因为它们能够在转录后调控基因表达。此外，由于miRNA相对稳定，并且可以在各种生物体液中发现，这些小分子也成为许多疾病的生物标志物，如癌症、神经系统疾病和免疫系统疾病。
miRNA通常是利用RT-qPCR和芯片来研究的，但西北大学NUSeq核心实验室的主任Xinkun
Wang指出，这些技术只能分析已知的miRNA种类，不能探索新东西。“有了miRNA测序（miRNA-Seq），你就可以发现一些新东西。”
尽管miRNA的测序在本质上与其他RNA相同，但样本处理时的一些步骤却是不同的。这篇文章将介绍一些最新的方法，帮助你高效制备miRNA-Seq的文库。
miRNA，而非mRNA
QIAGEN NGS产品开发的副主管Jonathan
Shaffer认为，目前的文库制备和PCR技术已经相当好，不需要特别富集小RNA（smRNA）。最关键的要求是RNA制备要干净，且没有肝素（这是一种相当强的RT抑制剂）。
需要注意的是，在提取RNA时应保留小RNA。加州大学戴维斯分校的Lutz
Froenicke表示，修改标准的RNA提取方案，采用更高浓度的盐沉淀，可以确保小RNA被回收。对于那些倾向于试剂盒的研究人员，他建议使用Zymo
Research的产品，因为它们“价格便宜效果好”。如果起始量低，他建议使用Norgen Biotek的试剂盒。
mRNA的文库制备通常是从片段化开始的，然后通过随机引物法来产生cDNA。不过，miRNA非常小，也就不需要片段化。“如果你使用随机引物，那么合成将从分子中间的某个地方开始，漏掉了大约10个碱基，”Froenicke解释说。因此，miRNA的文库制备是直接在RNA上连接3’和5’接头，同时创建模板，让引物可以结合。
讨厌的接头二聚体
然而，这种接头连接的策略也带来了一些棘手问题。3’和5’接头可能彼此连接，形成二聚体。二聚体过多的话则占据了宝贵的测序资源，使得较低丰度的物种无法测序，甚至造成整个运行损失。Takara
Bio USA的科学家Marta
Gonzalez-Hernandez表示：“仪器需要一个非常多样化的文库，以确保它们能够区分各个簇，并为你提供正确的序列，而接头二聚体始终是相同的序列。”
