《Nature Genetics》打开长非编码RNA测序新篇章

该方法被称为“RNA捕获长测序（RNA Capture Long Seq，CLS）”，它偶联靶RNA捕获和Pacific Biosciences（PacBio）三代长读长测序，采用最先进的测序方法进行扩增和分析，专门针对基因组的非编码区，可用于改进已登记的基因模式或鉴定新基因位点。

（自动化、高质量转录组注释战略）

用CLS捕获有注释的（蓝色）或绘制可疑位点（金色）的新转录组结构（下方黑色短线代表寡核苷酸，用来捕获跨区目标）。其中，PacBio 文库直接来自被捕获分子，而Illumina HiSeq短读长测序则用于预测剪接点（splice junctions，SJ）的独立确认。使用CAGE簇（CAGE clusters）确认预测转录起始位点，PacBio读取（红色）通过非基因组编码polyA+测序确认转录终止位点。浅蓝色的虚线轮廓矩形代表新外显子。

snRNA代表小核RNA；snoRNA代表小核仁RNA；UCE代表超级保守元素；PipeR pred.代表通过PipeR29制备的人类lncRNAs的小鼠基因组同源预测；Prot.coding代表表达匹配，随机选择的蛋白质编码基因; ERCC代表spike-in序列; Ecoli代表随机大肠杆菌基因组区域（增强子和UCEs的两股链都设计了探针，在这里分开计算）。

（技术路线）

研究人员将被捕获的cDNA按大小分为三组：1-1.5kb、1.5-2.5kb和2.5kb以上，随后被用以构建PacBio 单分子实时（SMRT）测序技术的测序文库。

130个SMRT细胞样品测序总计获得人类和小鼠各获得200万个读长。通过多路解编PacBio读取（ROIs）以及全基因组绘图，结果显示出了非常高的绘图率（两种物种都大于99%），其中86%是人类特有的，88%是小鼠特有的。ROIs的平均长度为1-1.5kb，这一结果超越了之前有注释的lncRNA的平均长度（约0.5kb）。

捕获表现主要体现在两个方面：一是中靶（on-target）率，即源于探针区的读取比例，二是富集程度，或者说是捕获后中靶率的增加。为此，研究人员用MiSeq分别测序了捕获前和捕获后的文库。结果显示CLS的中靶率（29.7%/16.5%）和富集程度（19倍/11倍）与此前基因间区段lncRNA的短读长研究相当。虽然与cDNA片段中靶率相当，但是，与基因组DNA捕获相比，CLS还有不足，意味着在捕获效率上长cDNA片段存在损失。

2003年作为编码“DNA元素百科全书”项目的一部分， Roderic Guigó成立了迄今为止最有影响力的人类和老鼠基因组数据库之一“GENCODE”。本文，研究人员用CLS改善了GENCODE。在Guigó和合作者们共同努力之下，已经完成了基因目录的大量改进工作，尤其是lncRNAs部分。“在这项研究中，我们生成了人类和小鼠3500个新长非编码RNAs的详细图谱（金色），占目前已知的所有lncRNAs（TOTAL）的20%。我们还表征了lncRNAs的基因组特征以了解这些非编码基因的工作原理，”共同一作、CRG研究员Julien Lagarde和Barbara Uszczynska说。

“人类基因组中98%DNA都不编码蛋白质，距离我们完全理解它们的功能和在疾病中的角色还有很长的路要走。为了达到这个目标，我们需要完整的基因组图谱。我们的新方法朝这一方向迈出了重要一步，”CRG校友、目前是伯尔尼大学的首席研究员、本文共同领导者Rory Johnson说。

“这种更便宜、更快和更准确的目录优化方法将首先受益全世界的科学家，继而改变世界，”Guigó总结道。