中国科学院青岛能源所建立紫花苜蓿高效简捷基因编辑体系

紫花苜蓿被誉为 “ 牧草之王 ” ，是全世界广泛种植的饲草作物。随着生物育种技术的不断发展，苜蓿分子育种工作也取得了一系列的重要突破。基因编辑技术能够精准高效地创制具有优良育种性状的苜蓿种质新资源，因而成为国内外苜蓿育种研发领域激烈角逐的核心技术之一。苜蓿高效基因编辑体系的开发需要依靠高通量的遗传转化技术与高效的基因编辑器。然而紫花苜蓿的遗传转化流程繁琐，且对操作人员技术经验与受体材料的遗传背景具有严重的依赖性，导致其转化效率高低不一。另外，紫花苜蓿为同源四倍体作物，基因组复杂，同一靶标基因的不同 sgRNA 的编辑效率千差万别。虽然当前国内外研发人员已成功开发了多种不同类型的紫花苜蓿基因编辑载体，但均使用 Pol III 型启动子驱动 sgRNA 表达，难与使用 Pol II 型启动子驱动的 Cas9 较好地 协同表达。

近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所付春祥团队在 The Crop Journal 在线发表了题为 “Development of a single transcript CRISPR/Cas9 toolkit for efficient genome editing in autotetraploid alfalfa” 的紫花苜蓿基因编辑技术体系开发的研究论文。

研究人员选择紫花苜蓿重要品种公农1号为底盘资源，采用操作简便、侵染效果稳定的超声辅助侵染技术，建立了公农1号高效遗传转化体系（转化率达到50%以上，图1），该技术有助于紫花苜蓿规模化遗传转化生产线的建立。

图1 公农1号紫花苜蓿超声辅助叶圆盘高效遗传转化体系

在此基础上，研究人员采用拟南芥UBIQ10组成型强启动子启动 Cas9 和sgRNA模块以单一转录单元进行协同高效表达，并利用基于tRNA的多sgRNA串联，在紫花苜蓿中实现了同一基因或不同基因多个靶位点的高效编辑（图2）。该载体系统简捷、高效，在包括苜蓿（紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、杂花苜蓿等）、杨树、烟草等重要作物的基因编辑中具有通用性，方便不同研究团队在双子叶作物基因编辑育种研发中的使用。目前该载体系统已被来自国内科研院所的20多个相关团队试用，并获得良好的反馈。

图2 紫花苜蓿高效简捷基因编辑载体

此外，研究人员还发现sgRNA的选择是决定紫花苜蓿基因编辑成功与否的另一个关键。然而，紫花苜蓿原生质体制备与转化体系对操作人员技术要求高，而紫花苜蓿叶圆盘法遗传转化周期长，两者均无法实现高编辑效率sgRNA的快速筛选。先前，研发者团队建立了蒺藜苜蓿sgRNA筛选的毛状根技术体系，然而该体系无法快速区分实生根和毛状根，制约了其在紫花苜蓿中的进一步应用。因此，研究人员基于 MtLAP1 转录因子过表达累积花青苷 “显色”的原理，开发了一套基于可视化毛状根的sgRNA高效筛选系统（图3）。与非可视化的工具相比，可节省60%~70%的样本检测成本。

图3 基于可视化毛状根的 紫花苜蓿 sgRNA高效筛选系统

最后，研究人员利用构建的一整套技术体系对紫花苜蓿叶发育的关键基因 PALM1 进行编辑，成功获得了包括公农1号在内的高叶/茎比和高蛋白含量的紫花苜蓿种质资源（图4）。该工作有助于推动基因编辑技术在我国苜蓿生物育种研发中的广泛应用，同时还能够加速具有优良农艺性状苜蓿核心种质资源的创制。

图4 palm1 基因编辑紫花苜蓿新材料