夏老师在 PubMed 冲浪时，刷到了浙江大学发表于影响因子 14.5 分的 Cell 子刊 Molecular Cell 上的一则回应（Response）。回应这类内容往往暗藏玄机，通常意味着原文章可能遭受了质疑（
我们都知道，科研的过程中，通过严谨的推理以及合理的实验设计，是可以让课题尽量趋近于真相的，在科研的推理过程中，使用归纳法和演绎法，才是科研本身该有的样子，对于质疑其实也不必太过担心，不清楚科研推理以及演绎法和归纳法的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。带着好奇，夏老师接着往下查看，果不其然，一篇质疑文章映入眼帘。这瞬间勾起了夏老师的兴趣：究竟是什么原因引发了这般质疑？最初发表的那篇文章实际研究情况如何？后续的回应又是否合理呢？
探寻答案，得从原文章入手。夏老师随即仔细研读了浙江大学最早发表在 Molecular Cell 上的这篇论文。文章聚焦于 AMPK 信号通路（
这是生物领域中常见的响应能量变化的信号通路。AMPK信号通路通常玉ATP和ADP的浓度有着密切的关系，倘若你对 AMPK 不太熟悉，强烈推荐去翻阅《信号通路是什么鬼？》系列内容，其中详细阐述了 AMPK 与 ATP、AMP 以及糖代谢之间千丝万缕的联系
）。客观来讲，这篇文章极具看点。从创新性层面，再到中间一系列严谨的验证内容，都展现出了较高水准。不过，在文章收尾部分，确实存在一些容易让人觉得不够严谨的地方。接下来，就让我们一同深入剖析这篇文章：
在正式研读这篇文章之前，我们有必要先熟悉 AMPK 信号通路。AMPK 由 α、β 和 γ 三个亚基构成，激活状态下，由 AMPKα 负责对下游分子进行磷酸化操作（
需要注意的是，这种磷酸化作用并非一概而论地起到激活效果，在某些情况下，也会呈现出磷酸化抑制现象。AMPK 下游广泛影响着众多其他信号通路的传导，堪称经典信号通路之一。若对其不甚了解，可回顾《信号通路是什么鬼？》系列加深理解
）。而这篇文章着重讲述的，便是 AMPKα 和 AMPKγ 这两个亚基之间的关联：
研究团队率先运用 CRISPR 技术，分别敲除了两个 α 亚基（αDKO），或者三个 γ 亚基（γTKO）。实验结果显示，当缺失 AMPKα 后，即便处于低葡萄糖条件下，eEF2 的磷酸化依旧能够被激活；然而，当缺失 AMPKγ 后，在相同的低葡萄糖条件下，却无法激活 eEF2 的磷酸化（
这其实也就是柯霍氏法则的验证，通过缺失某个关键因素，查看对于表型所产生的影响，而这一现象表明，在能量胁迫环境中，eEF2 的磷酸化过程很可能受 AMPKγ 的影响，而非 AMPKα，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）：
实际上，这一结果已然相当有趣。鉴于 AMPKα 和 AMPKγ 本身能够形成复合体，而通过上述验证却发现，AMPKα 和 AMPKγ 的功能或许各自独立，即 AMPKγ 存在不依赖 AMPKα 的独特功能。研究团队进一步借助 AMPK 变构激活剂展开分析，结果表明，变构激活并非影响 AMPKγ 激活 eEF2 磷酸化的关键因素；与之相反，使用能量抑制剂却能够有效激活 AMPKγ 对 eEF2 磷酸化的促进作用。此外，AMPKγ 的核苷酸结合位点一旦发生突变，便会对其影响 eEF2 磷酸化的能力产生作用，且这些影响均不依赖于 AMPKα：
明确了这一点后，新的疑问随之而来：AMPKγ 究竟是如何对 eEF2 磷酸化产生影响的呢？研究团队首先将目光投向了 eEF2 磷酸化激酶 eEF2K。eEF2K 虽然能够受到 AMPK 的调控，但调控 eEF2K 的并非只有 AMPK。基于此，研究人员对 eEF2K 上受上游调控的磷酸化位点进行了突变操作（
这一验证方法相当巧妙，本质上是柯霍氏法则的筛选过程。通过这种方式，能够精准分析出究竟是何种上游因素作用于 eEF2K 的激活，同时有效避免了肯定后件的逻辑谬误。若对柯霍氏法则和肯定后件不太熟悉，可参考《轻松的文献导读》《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》以及《信号通路是什么鬼？》系列加以学习
）。通过突变实验，他们发现 AMPKγ 并未通过 eEF2K 对 eEF2 产生磷酸化激活作用；而 mTOR 对 eEF2K 的磷酸化激活作用却十分显著。这就意味着，在能量胁迫条件下，AMPKγ 对 eEF2 产生的磷酸化影响，并不依赖于 mTOR - eEF2K 轴：
这一结果着实令人费解。既然 AMPKγ 对 eEF2 的磷酸化激活并无直接影响，那么研究团队提出了全新假设：假设 AMPKγ 影响的是 eEF2 的去磷酸化过程。（
假设的迭代，就是一篇文章推进的关键，通过之前的实验结果，得到一定的总结，而通过汇总这些结果后，确定下一步要研究的方向，并提出一个新的可证伪的命题，这就是假设的迭代，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）该如何理解这一假设呢？简单来说，就是假设 AMPKγ 能够通过抑制 eEF2 的去磷酸化，进而维持 eEF2 的磷酸化水平。那么，如何找出这个潜在的 eEF2 去磷酸化酶呢？这个去磷酸化酶需要具备两个关键特征：其一，能够与 AMPKγ 相结合；其二，能够响应能量胁迫条件下对 eEF2 的去磷酸化。经过一系列筛选，研究团队锁定了 PPP6C：
进一步研究发现，当出现葡萄糖剥夺情况，以及 AMP/ATP 比例发生变化时，PPP6C 与 AMPKγ 的结合程度提高：
同时，研究团队分析了 AMPKγ 上核苷酸结合位点突变对其与 PPP6C 结合的影响，结果显示，突变后两者结合能力明显减弱。此外，AMPKγ 还会通过 PPP6C 调节能量胁迫下的蛋白质合成：
其实，看到这里，不知大家是否已经察觉到这个验证过程中存在的一些问题，而这些问题极有可能成为被人诟病的关键所在。原因何在？在分析 AMPKγ 和 PPP6C 的结合情况时，研究团队并未对 PPP6C 进行突变，而是选择突变了 AMPKγ 的 CBS（胱硫氨酸 β 合酶结构，即腺苷酸结合位点）。如此一来，AMPKγ 是否通过 PPP6C 对下游产生影响，便存在一定的不确定性。虽然 AMPKγ 和 PPP6C 能够结合，且 PPP6C 也会响应能量胁迫，但这并不足以确凿证明 AMPK 一定是通过 PPP6C 产生影响的。毕竟，从验证逻辑角度来看，关键验证点理应在于 PPP6C（
不知大家读到此处是否能够理解这一表述的含义，实际上这涉及到充分条件假言推理中的肯定后件问题，由于命题中对于概念外延的不明确，就会导致类似的科研逻辑谬误。若对此不熟悉，可查看《科研的推理和逻辑：从实验台 到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列进行深入了解
）。最后，研究团队还分析了 AMPKγ 会通过 PPP6C 影响的下游其他蛋白的磷酸化调控：
最终，研究成果形成了这样一幅示意图：在能量胁迫条件下，AMPKγ 会通过结合 PPP6C，抑制 PPP6C 的去磷酸化功能，从而影响下游 eEF2 的磷酸化，并且这一过程独立于 AMPKα 和 mTOR - eEF2K：
总体而言，这篇文章在创新性方面表现卓越，验证过程也相对严谨，后期引入 PPP6C 更是为研究增添了新的视角。不过，在最后的验证环节，确实存在一些细微瑕疵，而这些瑕疵很可能成为他人质疑的切入点。至于这篇文章究竟是如何被 “质疑”，以及研究团队又是怎样回应的，我们留待下次再探讨。好了，今天的分享就先到这里。倘若大家感兴趣，不妨去研读一下原文，这篇文章的研究思路确实十分精妙，祝愿大家在科研探索之路上都能保持敏锐的洞察力，收获满满。今天就策到这里吧，祝你们心明眼亮。
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