单细胞与空间转录组测序数据关联分析思路

在前面的 《 单细胞转录组与TCR/BCR测序数据关联分析思路 》 和 《 单细胞转录组与单细胞ATAC测序数据关联分析思路 》 文章中，我们介绍了单细胞多组学的分析思路与方法，这些技术需要将细胞从组织中分离出来，从而丢失了细胞空间位置和相互作用的信息。近年来新兴的空间转录组技术能够还原组织形态和细胞空间位置信息，但其分辨率通常达不到单细胞级别。因此，通过将这两种强大的技术相结合，可以产生高分辨率的空间单细胞图谱，产生1+1远大于2的效果。今天，我们将探讨它们关联分析的思路并结合案例来讲解思路应用的方法。

关联分析思路

在之前的 《 空间转录组与单细胞转录组关联研究，轻松发表顶级期刊 》 文章中已介绍过整合单细胞转录组和空间转录组数据的两种主要方法和原理 ^[1] ：去卷积（Deconvolution）和映射（Mapping），其本质就是利用单细胞转录组得到的单细胞图谱和空间转录组得到的空间图谱进行整合进而得到空间单细胞图谱的过程，下面主要介绍后续的分析思路和方法。

图1 两组学关联分析思路

首先，通过构建空间单细胞图谱，我们可以探究目标细胞亚群的分布特征，以及目标基因在空间上和细胞亚群的分布。接着，可以进行亚群上调基因分析和富集分析，挑选上调倍数最高的基因做为亚群特征基因，并探究其在空间和不同细胞亚群的分布。

进一步，可以探究基因和细胞的共定位，从而揭示基因的配受体和转录调控关系以及细胞之间的相互作用。还可以将空间区域、细胞和基因与组织表型数据相关联，从而探究空间特征分布与表型功能的关系。

接下来，可以通过空间拟时分析构建细胞的空间拟时分化轨迹，并结合差异基因分析来挖掘亚群的空间发育特征基因和分化驱动基因，从而揭示细胞发育分化的调控机制。此外，还可以通过RNA速率分析来帮助推断细胞分化的方向性，并与拟时分析的结果相互验证。

此外，我们可以通过细胞亚群的空间位置信息和配受体对数据来推断它们的互作关系，在筛选出关键的互作细胞对后，可以进一步研究它们的配受体基因对及其分子调控机制，还可以通过组间差异分析来探究实验处理对细胞通讯的影响。

最后，还可以结合转录因子分析和网络分析来构建转录调控网络，筛选出关键基因和转录因子并探究它们的空间共表达，从而揭示关键通路的调控机制以及与表型的关联。

应用案例

接下来通过以下两个案例带大家来看看上面的研究思路在分析中具体是怎么应用的。

在这篇23年发表在 Cell （IF=45.5）的文章中，作者对人类6-23孕周（GW）的不同脑区进行了单细胞转录组和空间转录组测序，构建了多区域人脑的时空图谱，揭示了不同细胞类型的空间分布模式（图2AB）。然后，作者进一步探索了人脑神经前体细胞（NPC）的异质性，将其再分群为5个亚群（图2D）。其中放射状胶质细胞（RG）是最先出现的，并且表现出明显的区域异质性（图2CF）。此外，转录因子 TFAP2C 在RG中特异性表达并能够决定RG细胞的命运（图2E）。总之，这里使用了第一个研究思路，探究了人脑细胞亚群的空间分布特征。

图2 人脑发育的时空转录组图谱 ^[2]

接下来，作者使用拟时分析重建了来自五个区域的特定神经元亚群的发育轨迹。发现皮层（Cor）放射状胶质细胞（vRG和oRG）分化为大脑特异性中间祖细胞（IPC）和先体细胞（Prec2），最终发育为皮质谷氨酸神经元（Glu1和Glu4）（图3A）。节丘（GE）中的Sp-RG向皮层中的GABA能神经元发展（图3B）。间脑放射状胶质细胞Dien RG-1趋向于向 LHX6 + GABA能神经元发育，而Dien RG-2趋向于向谷氨酸能神经元发展（图3CD）。同时，空间可视化结果显示，Dien RG-1和 LHX6 + GABA能神经元主要位于Dien腹侧，而Dien RG-2和Dien谷氨酸能神经元主要位于Dien背侧（图3EF），这进一步验证了单细胞数据分析的结果。总之，这里使用了第三个研究思路，使用空间拟时分析探究了不同脑区特定神经元亚型的发育。

图3 目标细胞亚群的拟时空间分布 ^[2]

最后，作者通过细胞通讯分析探究了神经胶质细胞与GABA能神经元之间的相互作用。发现配体相关基因 NCAM1 和 NRXN1 在早期OPC-1和GABA-7中高表达，受体相关基因 L1CAM 和 NLGN1 在GABA-7和早期OPC-1中分别富集（图4A），且这些相互作用更多地发生在腹侧间脑（VD）（图4B）。同时，作者还发现神经胶质细胞和其他区域的神经元之间存在相互作用，早期OPC-2聚集在Cor和次帕皮质（Sp）之间的边界，而Glu1和Glu4分泌 E RBB4 的配体 NRG1 吸引OPC迁移到Cor（图4C）。总之，这里使用了第四个研究思路，揭示了神经胶质细胞与神经元之间的相互作用以及神经胶质细胞在发育过程中的空间分布偏好。

图4 神经胶质细胞空间分布及相互作用 ^[2]

图5 人小脑发育的时空转录组图谱 ^[3]

接下来，作者使用拟时分析构建了GC谱系的发育轨迹，将GC祖细胞分为 ATOH1 + GC祖细胞（AT+GCPs）和 NEUROD1 + GC祖细胞（ND+GCPs）（图6AB）。在GW13中ND+GCPs位于AT+GCPs的下方，有内外分离的分布特征（图6C）。接下来，选择在祖细胞或有丝分裂后细胞中富集的转录因子用于基因调控网（GRN）分析，来鉴定可能在GC分化过程中调节细胞状态转变的关键基因。发现除了 ATOH1 外， YBX3 和 MEF2C 等转录因子可能参与GC的发育（图6D）。总之，这里使用了第三和第五个研究思路，探究了GC谱系的分化发育和调控机制。

图6 GCs谱系空间分布及分化调控网络 ^[3]

总  结

综上所述，通过单细胞与空间转录组的联合应用，我们可以同时发挥空间转录组空间信息的优势和单细胞分辨率的优势，从多维度全面探究细胞亚群的分布特征、发育分化、相互作用和调控机制。

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