关节软骨组织的
3D
打印面临着如下挑战：复制其复杂的结构，耗时长的体外干细胞培养，以及缺乏强大的骨软骨缺损（
OC
）原位再生方法。
对此，兰州大学范增杰教授团队提出了一种创新的方法，利用预先设计的生物墨水模块单元进行一步打印和立即植入，避免了事先进行体外干细胞培养的需要。所得到的打印支架不仅准确地再现了关节软骨组织的三层结构和材料梯度，而且通过羟基磷灰石纳米纤维的增强和与水凝胶的化学键的建立，还获得了较强的抗压强度（
6.3 MPa
）
。此外，该支架通过化学交联适体和负载基质细胞衍生因子
-1
α
（
SDF-1α
）
包裹的聚乳酸
-
乙醇酸（
PLGA
）纳米球，在底层和顶层整合了干细胞捕获和归巢。这种设计可以通过适体相互作用在体内特异性捕获骨髓间充质干细胞（
BMSC
），然后通过
SDF-1α
浓度梯度的趋化作用将它们动员到透明软骨层。在支架的微环境中，这些
BMSC
在每一层都会分化为不同的细胞，有效地促进兔
OC
缺损区的修复。
为了实现关节软骨组织的一步
3D
打印，研究者预先设计了三个不同功能的生物墨水模块单元。首先，研究者以海藻酸钙（
CA
）和聚丙烯酰胺（
PAM
）组成的双网络水凝胶作为基质，引入γ
-
甲基丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷（
KH570
）改性的羟基磷灰石纳米纤维（
HANF
）作为增强材料，每一模块中都含有不同量的
KH570
修饰的
HANF
。对于下层油墨模块单元，以
HM69
适配体通过醛基化海藻酸钠（
OSA
）的羧基和
HM69
的胺基之间的酰胺化反应来修饰海藻酸钠（
SA
），并引入了
70%
的
KH570
修饰的
HANF
。在中间层油墨模块单元中，未对水凝胶基材进行改性，而是引入了
40%
的
KH570
改性的
HANF
。对于上层墨水模块单元，将
SDF-1
𝛼
包裹的
PLGA
纳米粒子引入到水凝胶基材中，不添加任何
KH570
修饰的
HANF
（图
1
），从而打印了可在体内捕获和安置
BMSC
并反映自然关节软骨组织三层结构的支架。
紧接着，研究者对支架进行了表征。
X
射线衍射仪（
XRD
）和傅立叶变换红外光谱（
FTIR
）证实了
HANF
的成功合成和
HANF
与水凝胶的成功复合。扫描电子显微镜可观察到支架明显的三层结构。该打印支架具有较高的保形能力和优异的力学性能，即使在折叠和卷曲状态下，它们仍然可以保持其结构完整性（图
2
）。
由于干细胞捕获是原位诱导再生的第一步。跨孔迁移实验证明用包裹
SDF-1
𝛼
的
HM69
和
PLGA
纳米球功能化的打印支架具有比其他支架更强的募集能力。免疫荧光染色证实了
HM69
和
SDF-1
𝛼
功能化修饰是体内诱导
BMSC
归巢和迁移的有效方法（图
3
）。
然后，研究者通过量化细胞存活率、细胞黏附和增殖来检测支架的生物相容性。活
/
死染色证明了所有支架良好的生物相容性；根据鬼臼毒素
/Hoechst
染色结果，不同支架上培养的细胞均呈现清晰的细胞骨架形态和正常铺展状态；
5-
乙炔基
-2‘-
脱氧尿苷（
EDU
）掺入法检测到
GS69
组支架对
BMSC
体外增殖能力无不良影响。以上结果证明了支架具有良好的生物相容性（图
4
）。
为了评估打印支架的软骨再生能力，研究者建立了兔
OC
缺损区模型。大体观察、
Micro-CT
重建结果证明了
GS69
支架具有良好的
OC
再生能力（图
5A
）。为进一步证实上述观察结果，研究者对缺损处新形成的骨进行了定量评估，骨体积（
BV/TV
）结果表明，在水凝胶中加入
HANF
增强了骨的再生能力，使支架与宿主骨形成紧密的结合（图
5B
）。此外，该研究还进行了国际软骨修复学会的宏观评估，由三名独立的研究者进行了宏观盲法评估，进一步证实了
GS69
支架对
OC
缺损区的修复作用（图
5C, D
）。
随后，研究者通过组织染色、和改良的
O‘Driscoll
组织学评分系统盲法评价修复后软骨的微观结构，发现与先前研究中报道的利用体外培养的干细胞修复支架的结果相比，该研究中的支架显示出更高的疗效（图
6
）。
最后，免疫荧光分析证明了
BMSC
的定向迁移可以为每一层提供充足的干细胞，这些干细胞在支架提供的诱导微环境的帮助下分化为每一层特定的细胞类型。免疫组化染色证实
GS69
支架提供的合适的微环境可以显著促进
BMSC
向软骨细胞和骨细胞分化，从而有效促进软骨和骨组织再生。这一结果表明，单独释放
SDF-1
𝛼
对诱导骨
BMSC
向软骨细胞分化没有明显的作用，这也表明促进干细胞分化的主要原因是支架的力学性能和微环境相互协调（图
7
）。
综上所述，该研究展示了软骨组织工程领域的几项重大创新：一、该打印支架不仅准确地再现了关节软骨组织的三层结构和材料梯度，而且通过羟基磷灰石纳米纤维的增强和与水凝胶的化学键的建立，获得了令人印象深刻的抗压强度（
6.3 MPa
）。二、支架的复杂设计由干细胞捕获层和归巢层组成，为从骨髓腔捕获和动员
BMSC
到损伤部位提供了一种独特而有效的方法。这种方法是随后干细胞黏附、增殖和分化的基本前提。三、支架的仿生设计结合了材料和结构梯度模拟，为骨髓间充质干细胞在每一层内分化为不同的细胞类型建立了良好的微环境。因此，这种方法允许定制受损的关节软骨组织，并通过利用
3D
打印技术高效地生产支架。
通过将多种功能融合在一个支架中，可以立即将其植入受损的软骨部位，从而消除了体外干细胞共培养的需要。因此，一步法
3D
打印软骨支架可以即刻植入和原位诱导骨软骨再生是传统治疗方式的重大进步，在
OC
修复中显示出巨大的潜力。
该研究由兰州大学范增杰教授团队完成，并于
2024
年
6
月
1
日在线发表于
Advanced Functional Materials
。
论文信息：
Huajing Zeng, Ziyan Chen, Pengyu Wei, Haofei Huang,
Bin Liu, and Zengjie Fan*. Rapid Customization of Biomimetic Cartilage Scaffold
with Stem Cell Capturing and Homing Capabilities for In Situ Inductive
Regeneration of Osteochondral Defects. Adv. Funct. Mater. 2024, 2400608.
供稿：何辉
审校：李家颖
编辑：季威
