SV40和HPV为什么致癌？DNA病毒全知道（一）

朋友们经常会用到293T细胞，这里的T是指的什么？

我们经常说大T抗原，小T抗原，这里的大T和小T抗原分别指代什么？

我们经常说要打HPV疫苗，那么HPV疫苗是干什么的？

我们常用的SV40启动子，SV40内含子，SV40终止子，SV40NLS，这些之间又有什么样的关系？

DNA病毒主要被分为两大类：单链DNA病毒和双链DNA病毒，其中Parvoviruses 细小病毒是在动物病毒中唯一的一个ssDNA单链病毒，双链DNA病毒则丰富的多，主要可以分为三大类：

1. 小的DNA基因组（<10kb）比如多瘤病毒和乳头瘤病毒。

2. 中等大小的DNA基因组比如腺病毒。

3. 第三类则是一些巨大的DNA病毒，往往大小在150-250kb，比如疱疹病毒。

在第一类病毒中最著名的便是SV40，在20世纪70-80年代，由于SV40非常容易进行培养，而且由于很小的病毒基因组大小，容易进行遗传操作，同时，SV40可以当做模型用来研究癌变的相关机理。因此SV40得到了空前的研究。

SV40是小的非包膜病毒颗粒，其中VP1五聚体形成了二十面体的结构，在二十面体的里面是一个VP2/VP3，VP2倍myristate脂修饰，这在SV40逃脱内体进入细胞质中具有重大的作用。

在衣壳里面的是病毒DNA基因组，DNA被组蛋白缠绕，形成类似核小体的结构物。不同于细胞的核小体，SV40的minichromosome并没有H1组蛋白。由于SV40基因组简单的结构，因此成为真核DNA复制的经典模型。

293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。 

什么是大T抗原和小t抗原?
是SV40表达的两种蛋白,为什么叫这两个名字?分别有什么作用呢?在其他病毒或细胞中是否也有表达?

SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumor antigen,T抗原),其分子量分别为94000(大T抗原)和17000(小T抗原).T抗原有以下的作用:①大T抗原为细胞转化的启动所必需;②转化细胞表型的维持必需要有大T抗原的连续表达;③小T抗原对于细胞的转化不是必需的,但可起加强作用.SV40病毒引起的转化是一个复杂的过程,目前尚难将转化细胞的生物学特性改变与SV40大T抗原的特异生化性质联系起来.一般有两种假说进行解释①SV40病毒编码的转化蛋白作用于细胞的质膜改变了细胞生长必需的功能;②转化蛋白作用于细胞核调节DNA复制和基因表达的部分.现知SV40的大T抗原大部存在于转化细胞的核内,与核质、染色质和核的基质联结在一起.

SV40病毒基因组表达的一个重要特点是，它的RNA剪辑模式非常复杂。通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA)；而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。

这2种早期mRNA分别编码大T抗原和小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。晚期转录本按照其特定的沉降系数，可区分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vp1、Vp3和Vp2病毒蛋白质。Vp1编码区同Vp2和Vp3的编码区是以不同的转译结构形式彼此交叠的。

在SV40病毒基因组中存在着一个增强子序列。其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组DNA复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。

外源的基因可以融合在SV40 DNA的早期转录区段内，而SV40的增强子又能够有效地激活SV40早期转录单位的转录活性。因此显而易见，SV40增强子在哺乳动物的基因操作中是相当有用的。此外，SV40增强子还可以增强由细胞启动子启动的基因转录作用。

根据SV40病毒感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。我们称这种感染效应为裂解感染(lytic infection)，而猿猴细胞则叫做受纳细胞(permissive cell)。但如果感染的是啮齿动物(通常是仓鼠和小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，也就是说发生了癌变。我们称这种啮齿动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞(non-permissive cell) 。人体细胞是SV40的半受纳细胞(semi-permissive cell)，因为同SV40病毒接触的人体细胞中，只有1%～2%会产生出感染性的病毒。

SV40病毒对猿猴细胞的裂解感染可分成三个不同的时相。在感染了寄主细胞之后，有一段长达8～12小时的潜伏期，在这个期间，病毒颗粒脱去蛋白质外壳，同时DNA逐渐地转移到寄主细胞核内；紧接着4小时为早期时相，此时发生早期mRNA和早期蛋白质的合成，并出现病毒诱导寄主细胞DNA合成的激发作用；在这以后的36小时称为晚期时相。进行病毒DNA、晚期mRNA和晚期蛋白质的合成，并在高潮时发生病毒颗粒组装。大约在感染的第三天，细胞裂解，平均每个细胞可释放出105个的病毒颗粒。

SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。同其它病毒不同，SV40 DNA是同除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相结合。这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。感染之后的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。围绕在SV40 DNA复制起点周围约 400bp的DNA区段，是十分引人注意的。紧挨这个起点的DNA序列，是调节早期和晚期初级转录本合成的控制信号。早期转录本的合成，就是由位于这个区段内的由一对72核苷酸序列串联而成的强化因子序列激活的。

那么SV40为什么致癌？

p53基因是迄今发现与肿瘤相关性最高的基因。1979年，Lane和Crawford在感染了SV40的小鼠细胞内分离获得一个与SV40大T抗原相互作用的蛋白，因其分子量为53 kDa，故而取名为p53（人的基因称为TP53）[3]。起初，p53被误认为是癌基因，直到上个世纪90年代，人们才认识到引起肿瘤形成或细胞癌变的p53蛋白是p53基因的突变产物。野生型p53基因是一种重要的抑癌基因，它是细胞生长周期中的负调节因子，在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞分化、凋亡和衰老等许多过程中发挥了重要的生物学功能，因而被誉为“细胞卫士”（如图6）。随着研究的深入，人、猴、鸡、大鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等多种模式动物的p53基因也相继被克隆。

其中，人类TP53基因定位于染色体17P13.1，小鼠p53基因被定位在11号染色体上，并在14号染色体上发现无功能的假基因。在这些进化程度迥异的动物中，它们的p53基因结构却异常保守，基因全长16-20kb，都由11个外显子和10个内含子组成。其中第1个外显子不编码结构域，外显子2、4、5、7、8则分别编码5个进化上高度保守的结构域，转录形成约2.5 kb的mRNA。之后，在基因同源性的基础上又陆续发现了p53家族的其它成员，分别是p73和p63，它们也因各自的分子量而得名，具有和p53相似的结构和功能。

2) p53信号通路

p53基因受多种信号因子的调控。例如：当细胞中的DNA损伤或细胞增殖异常时，p53基因被激活，导致细胞周期停滞并启动DNA修复机制，使损伤的DNA得以修复。然而，当DNA损伤过度而无法被修复时，作为转录因子的p53还可进一步激活下游促凋亡基因的转录，诱导细胞凋亡并杀死有DNA损伤的细胞。不然，这些DNA损伤的细胞就可能逐渐脱离正常的调控，有可能最终形成肿瘤。

虽然正常状态下p53的mRNA水平很高，而且有大量蛋白质合成，但p53蛋白容易降解，所以正常细胞内p53蛋白水平很低。蛋白的泛素化（ubiquitination）修饰是细胞内蛋白代谢过程中的最普通的降解方式，p53蛋白的降解也是通过泛素化来实现的。MDM2是一种特异性针对p53的泛素化E3连接酶，它可直接与p53蛋白结合来促进p53蛋白的泛素化降解，并在细胞内p53蛋白动态平衡中发挥关键的作用。MDM2本身也可被p53蛋白激活，因此MDM2是p53通路中重要的负反馈调节因子（negative feedback regulator）（如图7）。

3) p53与肿瘤

p53基因敲除小鼠虽然可以产生后代，但其生长发育过程中会出现高频率的自发性肿瘤，这提示p53蛋白与肿瘤之间存在密切的关系。事实上，目前TP53基因是与人类肿瘤的相关性最高的基因，与50%以上的人类恶性肿瘤有关，而且现正已在超过51种人类肿瘤病例中发现TP53基因的异常表达和功能失活。TP53基因突变是其功能失活的主要原因，至今已发现400多种TP53基因突变类型，其中147种与胃肠道肿瘤有关，而最常见的突变方式是点突变。通过分析大量肿瘤病例中的TP53突变位点，证实肿瘤中95.1%的p53点突变位点发生在高度保守的DNA结合区，尤以第175、245、248、249、273和282位点的突变率最高（如图8）。此外，某些点突变改变了p53的空间构象，影响了p53蛋白与MDM2和p300等蛋白的相互作用。另一些点突变发生在p53的核定位信号区，使p53无法进入细胞核发挥转录激活的功能。不同肿瘤的TP53基因突变位点并不一致，例如：结肠癌中G:C→A:T转换占到79%；在乳腺癌中，G→T颠换占到1/4，而这种突变在结肠癌十分少见；淋巴瘤和白血病的TP53基因突变方式与结肠癌相似；在肺癌中G:C→T:A突变最普遍，而食道癌中发生G→T颠换的频率很高。

目前看来，在肿瘤形成的复杂网络和调控体系中，p53是最主要的因素。有人认为p53是很好的肿瘤诊断标志物，可以作为癌症早期诊断的重要指标。认识到p53基因的重要作用后，全世界数以千计的分子生物学家正在抛开原来的课题转而研究p53，希望以此作为攻克癌症的突破口。科学家相信，利用p53基因发现并治疗癌症的前景非常广阔。除了基因治疗，研究人员正在筛选可以影响p53基因上下游调控的小分子化合物。罗氏制药公司开发的一种名为nutlins的小分子化合物，能够干扰p53和MDM2之间的调控关系，有望成为一种有效的抗癌药物。

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