通过哺乳动物细胞培养生物过程模型预试验实现质量控制

运用重组哺乳动物细胞系制备的工业产品-复杂生物药始终主要以检验方法保证质量基础，其主要体现在固定化的过程控制和全面的终产品检测。在2004年，FDA启动了过程分析技术首创，旨在规范工业朝着更高级的过程监控，以及更好地理解关键过程参数如何影响关键质量属性。过程分析技术在生物制品中值被过程中的实施，能够使由检测决定的质量转向由设计决定的质量。高级监测系统的应用与数学模型技术相结合使过程一目了然，能够在线预测关键质量属性和随后实时产品质量控制。本文，将讨论在通过设计和动态控制的成功质量之路上的一些因素和未解决问题。一个主要的焦点是对于哺乳动物细胞培养生物过程模型预控制应用的导向先决条件。试验设计提供的关于参数改变、动态过程模型、在线过程状态预测和强大的软件环境等过程动态信息，看来是通过控制实现质量的先决条件。

哺乳动物细胞是复杂生物制品中应用最广的宿主细胞。批次培养模式下，搅拌式生物反应器已经能够实现超过20000L生产规模；而连续贯流培养模式的生产规模却是稳中有升。培养步骤是重组蛋白产品的关键环节之一，因为它对产品的产量和质量都有影响(例如产品的糖基化结构)。生物制品过程中的质量，导致产品属性实时测量的技术缺乏，一直主要通过完全一致的过程设定和大量终产品质量检测来保障。然而，在一个过程设定相同的生物过程，由于投入的可变性（例如原辅料、活细胞）也会产出质量不一致的产品。

2004年,美国食品和药物管理局已经公布了针对行业的过程分析技术(PAT)指南(行业指南:PAT-创新药品开发、生产、质量保证框架,食品和药品管理局,2004],旨在引导行业从通过死板的测试来保证质量向通过灵活的设计方法QbD)来保证质量转变。QbD在生物制品生产过程的实施有很多方法可以实现。通常，QbD策略开始于相关的目标产品结构和关键质量属性(CQAs)的定义 [ICH Harmonised Tripartite指南：药品的开发 Q8(R2)]，随着产品进展和应用范围发生着变化。接下来的过程开发过程步骤中，过程应答很可能对过程参数的影响是基于风险评估的预测，例如失败模式和影响分析。然后，通过统计学实验设计(DoE)、多变量数据分析和数学模型技术，寻找关键过程参数(CPPs)和产品质量属性之间的关系。随后，可以对过程操作空间进行定义，并应用传感器技术，实时监控关键过程变量。在最后一步(高级)，控制策略是开发最小变化的过程。最终，QbD针对闭环CQA控制和为了这个目的的模型预控制（MPC），一种在许多其他过程工程中成功应用的多变量控制方法，似乎是最合适的。MPC针对各种CQA参数（设定点），即根据投入工序，也根据工艺限制操作。通过对过程输入的操作来满足各种CQA规范(设定值)，同时也考虑过程约束。令人吃惊的是，或者我们宁愿这是故意的，PAT读起来很像一个实现高级过程控制的指南，就像是最终目标——闭环CQA控制——以及为了闭环CQA实现的不同QbD步骤的关联没有完全解决。高级过程控制需要对关键属性(监视)和描述CPPs和CQAs之间关系的过程模型进行度量。对CQAs灵敏度的了解至于在CPPs中的改变，是实现卓越控制性能的关键。这些关系到DoE方法的系统评估、关键参数的系统选择和关系到风险评估的属性，都被在QbD策略中建议应用，是一种很好的方法，但同时也要考虑过程动态。然而，对于所有朝着高级过程控制的QbD策略，在许多情况下对于过程控制的结果的影响是不清楚的。本文回顾了哺乳动物细胞的生物过程中，主要考虑与闭环CQA控制目标(通过MPC) 的QbD策略。高级过程控制应用的先决条件，根据以下问题的评估：

(i)哪种DoE最适合设计空间特征，找出CQAs和CPPs之间的关系，以及各自的过程动力学?

(ii)是否有可能度量相关过程变量和CQA依赖的数学模型，以预测过程性能和控制产品质量?

(iii)一个软件结构是否适合实时数据预处理、预测和控制CQAs?

DoE描述了一种统计方法学，用于系统地筛选和评估CPPs对过程响应的影响。使用优化工具进行过程响应特别评估，例如单形算法(顺序设计)或表面响应方法(并行设计)。许多不同的DoE方法已经被建立。在一种应用中，选择的DoE方法可以对获得信息的数量产生巨大的影响。由于操作的方便性，完全因子、部分因子-、中心组合或Doehlert设计等通常会用到。当处理大量的因素时，DoE展示出欠打的线性效应和正交直线主要效应，最终筛选设计时要注意选择其一。然而，根据设计的分辨率和准确性期望，单独使用统计学驱动方法非常艰难。既不增加给出试验（设定）信息数量，也不减少模型参数变化，一个基于DoE模型(MBDoE)，也称为优化试验设计可以被应用。过去的几十年，与传统DoE概念相比，尽管它还没有被普遍使用，这种方法已经被人们所熟知了。该方法基于一种半机械模型，建立在给定的过程知识基础上，用于预测下一组实验的信息内容。这些集合可以由按先后顺序或同时并行实验组成，也可以顺序和并行一起进行。这一领域最近的优势，比如降低计算工作量或者在线信息驱动的重新设计优化方法。虽然如此，MBDoE需要一个过程模型，这在过程开发的开始阶段可能是不行。如果哺乳动物宿主和培养基是相同的，并且产品(CQAs)与之前的过程相似，那么可能会采用之前的过程模型。最近，von Stosch等人提出了一种加强版的DoE (iDoE)方法，在一个实验中，通过执行过程条件变化，传统DoE的多个点被评估。结果表明，与传统的大肠杆菌表达策略方法相比，这种加强版DoE确实能在较少的实验工作量下，带来同样的信息。然而，对流程响应的分析，这是动态的，需要采用动态建模方法，例如半参数混合建模方法。对于哺乳动物细胞培养过程，采用这种方法时，必须周密考虑，因为代谢变化和细胞增殖可能会影响DoE试验。然而，操作过程中某些变量的变化，例如应用脉冲，可以帮助更好地解释过程动态变好，这对于动态过程控制策略的创建开发是很重要和必要的，例如MPC。MBDoE和新颖的iDoE方法为哺乳动物细胞的生物过程开发提供了互补的概念，很有前途，因为它们能够显著减少工作量，并提供有关该过程的动态特性的信息。

先进的过程控制方法，如MPC，需要一个动态的过程模型，它应该详细足以提供对过程的重要描述。但同时也相当简单，易于快速优化控制轨迹。哺乳动物细胞培养下的模型质量似乎是至关重要，因为不当控制行为可能会在培养中引发不可逆转的变化。据报道，迄今为止，有关哺乳动物细胞培养的先进控制模型包含了相对少量的化合物，典型代表是生物活性物质、总生物质量、葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和氨浓度等。自由的控制程度也仅限于葡萄糖，谷氨酰胺或两者。考虑到有几种可以用于控制的培养基组分，更复杂的模型将潜在的代谢物纳入考虑范围似乎更有保障。这个想法并不是新的，它已经被用于其他生物技术的建模。许多研究人员对哺乳动物细胞的代谢通量网络进行了研究。对杂交瘤细胞来说，一个基因组尺度的代谢网络模型已经被阐述。但是直到最近，还没有专门对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞基因组代谢网络的报道。建模代谢通量为细胞的生长需要和细胞的新陈代谢提供了一个更深的理解，尽管可能是细胞株和产品的依赖相关。虽然代谢建模可以为代谢工程提供直接目标，它不能解释为细胞外刺激的流量规则，这将是过程控制角度看最有趣的事情。动态代谢网络模型的发展，例如对于CHO，解决了这个缺点，但是这些模型不适合复杂过程控制目的，而且它们也不考虑温度、渗透压或pH值的依赖性。似乎，动态生物反应器模型中基本流量模型的组合(从代谢网络计算)提供了一个合适的选择,已成功地应用于CHO细胞培养动态描述和小仓鼠肾细胞培养的先进过程控制。后者使用一种混合建模方法来模拟基本模型活动(即校准)作为有人工神经网络的细胞外环境。由于这个校准还没有被很好地理解，所以通过数据驱动技术对未知部分进行模拟似乎是尤为有希望。同时，对渗透压、温度和pH值校准的依赖性也很容易被整合。基本知识(白盒)与数据驱动技术(黑盒)的结合，被称为混合(半参数)建模，也符合工业偏好，因为模型开发是系统的，并且展示了基本模型的许多优势。这种方法的缺陷是缺乏商业软件包，以及当前缺乏有经验的模型开发人员。考虑到控制CQAs的基本QbD目标，如单克隆抗体的糖基化结构或电荷异构体，很显然，这些模型必须描述这些属性的形成。在糖基化结构方面，在高尔基体和基础反应网络建模中已经取得了进展。然而，在电荷异构体方面，只有数据驱动的模型被应用。对多聚糖形成的敏感性变化受细胞外环境因素，例如温度、氨、锰和核苷酸糖等因素影响；电荷异构体也如此，显而易见的潜在影响维持CQAs的高级过程控制因素，限于培养基、补料和其他过程参数等。有鉴于此，混合建模似乎是一种作为基础知识关系合适的建模方法，它可以与数据驱动技术组合在一起，来表征未知的部分内容。

对于闭环产品质量控制，必须用测量值来修正混合物浓度的模型预测。只有当对混合物浓度的测量值可用时，对偏差的控制作用适用性才成为可能，即控制回路被关闭。从离线和在线分析方法获得信息，使之应用过程控制太晚了，因为在许多情况下，这些技术需要花费一些人工操作。此外，他们还被各种不同的错误来源所困扰。因此，实时测量有很大的需求，这能够提供关于过程状态和产品质量的信息。由于这些特性通常不能直接测量，因此需要所谓的软测量技术。软测量是一种非常有前途的方法，在这种方法中，大多数非特定的从探头传感来的测量值(例如，光谱)，被用来估计/计算生物过程变量，而这些变量是无法额外实时直接测量的。即使简单的软传感器，如实时计算氧气的吸收率或二氧化碳的生产速率，也能有益于监控过程。软测量可以是知识驱动的，也可以是数据驱动的。知识驱动的方法是从基础知识(例如:第一原则)发展而来的，描述过程变量和质量属性之间的关系。这些模型的准确性取决于过程知识体现。多变量数据分析工具，如主要成分分析或局部小方形通常应用于数据驱动的传感器，如Kadlec等人所讨论的那样，尽管这些方法不能处理非线性。迄今为止，已有超过1000个软传感器应用在工程领域发布，但在生物技术领域，只能找到少数几个。一个解释是可能由于细胞生物学的复杂性和被监控过程的重现性。在生物治疗性药物制造中软测量实施成功的例子是在其他地方得到的。在过去的几年里，与其他传感方法相比，非选择性光谱检测传感器变得更加重要。由于具有无创、健康和敏感性方面具有很高优势，对生物反应器的设计和生物系统有多种用途。

最近，在哺乳动物生物加工领域，几乎没有应用报告。Ohadi等人表明，多波长荧光光谱可以用来预测活细胞和死细胞的浓度、产品的浓度、底物(葡萄糖)和废物的浓度(氨)。最近几年，另一个非常吸引人的方法是拉曼光谱，人们对它有很高的兴趣，它允许间接测量各种关键生物的代谢变量。与特定的测量原理相反，建立的软传感器可能只在特定的范围内有效，对于给定的过程、细胞系、产品或培养基类型。因此，在转移到新工序之前，仔细验证已建立的软传感器是至关重要的。总结，软传感器在哺乳动物的生物过程中的应用，对于监控过程应该降低离线分析的需要。此外，我们希望软传感能够提供实时的状态评估，从而修正模型预测，最终使模型预测控制成为可能。

MPC可能是最为广泛采用的先进过程控制方法。该方法优化了可以被操纵的过程输入，这样矛盾的目标，即从设定开始就选择过程状态的最小偏差，以及最小的控制影响，在得到合适的折衷方案解决。通过对有限的预测层面的重复模拟，利用过程模型对该模型进行优化，优化过程极小。因此，最佳过程输入完全遵循过程的动态行为（如果确定了）和时间变化的约束条件。例如，这些约束可以确保流程不会离开预先确定的设计范围。对于具有长特征时间的哺乳动物细胞生物过程来说，对最佳控制策略的重新计算，在一小时内只要几分钟内就足够了。根据基础数学模型的复杂性和应用的约束，专门的数学解决方案将不得不应用于最小化问题。数学框架涵盖了上述功能，例如MATLAB和可链接的数据库（如CPLEX或GUROBI）。由于生物模型是高度非线性的系统，因此，用非线性/动态模型MPC方法的应用很可能变得必要。非线性MPC策略已经成功应用于生物过程。迄今为止，哺乳动物细胞培养的策略报告只用于一个或两个操作变量，分别是Craven 等 和Teixeira 等 ，但由于MPC允许多变量控制，可能所有培养基组分可以单独用来CQAs控制，如多糖具体或电荷异构体。应该强调的是，MPC的成功取决于(i)过程模型；(ii)模型组合的在线测量，寻求通过软测量获得。如果后者丢失(或者如果探测失败)，MPC将始终提供从过程模型计算的过程输入。然而，由于模型和工厂之间的偏差可能发生，并且由于控制器不能识别，计算的控制操作并不能使这个偏差最小化(被称为模型-工厂的不匹配)，所以输入并不是最优的。

在工业自动化环境中使用的分散控制系统(DCS)，没有提供数学工具箱的适当范围，应用于非线性MPC。原因之一，通常是应用到微控制器/可编程序逻辑控制器的有限计算能力。

图1 通过设计和控制产生的对哺乳动物细胞生物生物过程的质量曲线图。推荐的方法对每一步中都指出的动态过程控制非常必要。

    因此，需要在监控和数据获取(SCADA)级别上执行更复杂的优化。为复杂优化常规提供一个数学平台解决方案的供应商数量仍然有限(例如IPCOS，PerceptiveAPC，Wolfram MathCore)。此外，这些软件框架并没有集成到商业SCADA系统中，而是通过工业联系连接起来的。使用软传感器作为模型的输入，在线数据预处理(DCS, SCADA 系统)也与此相关。软件环境(DCS、SCADA系统)没有提供连接高级传感器和执行复杂的统计信号预处理步骤的可能性。因此，将数学平台直接集成到SCADA中变得越来越重要，甚至是必须的。

QbD的有益影响最终来到了生物制药行业。2013年，罗氏获得了第一个完整的基于QbD批准的单克隆抗体Gazyva® (Obinutuzumab)。然而，对于QbD执行的路线和方法，还没有一个黄金标准。此外，通过QbD所获得的过程知识增加仍然很少用于动态控制目的。对于在QbD框架内的MPC的实现和成功，有三个挑战被认定:

(i)需要动态模型来预测由于CPPs的变化而导致的CQAs的变化。新的DoE方法将导致工作负载的减少和/或更好地理解生物过程，它的动力学使更有意义和预测动态模型的发展成为可能。

(ii)需要软传感器提供对状态的评估，使校正动态模型预测和关闭控制回路成为可能。

灵活而强大的软件框架将是必不可少的，它提供了不同类型的数据集，分别在-和内联，并且在实时74中使用构建的模型。

(iii)必须有灵活而强大的软件架构，提供不同数据设定类型整合，在线和离线，用于实时建模。

我们建议按照图1所示的路线来实现哺乳动物细胞培养生物过程的非线性MPC。

参考文献：

Sommeregger W, Sissolak B, Kandra K, von Stosch M, Mayer M, Striedner G.Quality by control: Towards model predictive control of mammalian cell culture bioprocesses.Biotechnol J. 2017 Jul;12(7).