BioArt按
：
piRNA是近年来在动物生殖细胞中发现的
一类非编码小分子RNA，它可以与
PIWI蛋白相互结合形成PIWI/piRNA“机器”，
在动物生殖细胞发育分化过程中发挥重要作用。2013年刘默芳课题组就已经发现了
小鼠piRNA在精子形成后期触发其结合蛋白PIWI（MIWI）经APC/C-泛素化降解的新途径和piRNA诱导PIWI降解的新功能，
为精子形成异常导致的男性不育症发生提供了潜在的分子信息。
那么PIWI突变是否会导致雄性不育，更准确的说人类不育症患者中是否存在PIWI突变？5月25日，来自中科院生化与细胞所的
刘默芳
研究组和上海计划生育科学研究所
施惠娟
研究组合作在
Cell
上发表了题为“
Ubiquitination-Deficient Mutations in Human Piwi
Cause Male Infertility by Impairing Histoneto-Protamine Exchange during Spermiogenesis
”的研究论文，
该研究首次发现了PIWI蛋白突变致男性不育并深入揭示了相关的致病机理，还发现了在精子变形过程中引发组蛋白-鱼精蛋白转换的新机制，
为相关男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。
鉴于该工作在理论研究上的重要突破和潜在的应用前景，BioArt特别邀请了中科院动物所
陈大华
研究员和中科院生物物理所
俞洋
研究员撰写相关评论，以飨读者！论文通讯作者为
刘默芳
和
施惠娟
，第一作者分别为
苟兰涛
、
康俊炎
、
戴鹏
、
王鑫
和
李锋
。
特别值得一提的是，这是今年5月份，国内独立完成的第四篇研究型
Cell
论文，也是中科院上海生化与细胞研究所的第二篇文章（
陈玲玲
、
施一公
、
季维智/孙毅/陈永昌
、刘默芳），BioArt对上述成果都在第一时间做了详细报道。
论文解读：
撰文丨丁广进
点评丨陈大华研究员 俞洋研究员
piRNA是近年来在动物生殖细胞中发现的
一类非编码小分子RNA。
2006年，有4个独立的课题组几乎在同一时间报道了一类与PIWI家族蛋白相互作用的小分子RNA，长度约为24~32 nt，因为与PIWI蛋白相互作用，故称为PIWI-interacting RNA，简称piRNA。值得一提的是四篇论文中，其中一篇文章是来自耶鲁大学
林海帆
教授实验室（相关工作是在杜克大学任职期间完成的）【1-4】。
piRNA
起源于基因组中的反转座子、重复序列及一些被称为piRNA簇的区域，
piRNA与PIWI蛋白相互结合形成PIWI/piRNA“机器” ，
可以通过在表观遗传水平和转录后水平沉默转座子、反转座子等移动元件，维持生殖细胞自身基因组的稳定性和完整性，在配子形成过程中发挥重要作用。刘默芳实验室及其他国际同行实验室最近的研究显示，PIWI/piRNA机器也参与调控生殖细胞中编码基因的表达。
对
PIWI/piRNA“机器”
生物学功能及意义的研究，可以为相关男性不育症的诊断和治疗提供理论基础，具有十分重要的意义
【5】。
生殖细胞特异性表达的PIWI家族蛋白是piRNA作用途径的中心，是piRNA的生成及功能所必需。小鼠PIWI家族包括MILI、MIWI和MIWI2三个成员，特异性地在睾丸中表达，对小鼠精子发生至关重要。
刘默芳研究组近年来围绕“piRNA在哺乳动物精子发生中的功能和机制”方面做了大量系统的研究，取得了多项重要成果。
这些成果包括，发现
piRNA通过泛素-蛋白酶体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，并首次揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能
(
Dev Cell
2013
)； 小鼠粗线期piRNA指导父本mRNA在精子形成后期大规模降解(
Cell Res
2014
)；发现了小鼠piRNA可直接介导部分睾丸mRNA的切割，揭示了piRNA可在小鼠睾丸组织中发挥siRNA类似的功能，而且该功能为雄性生殖细胞发育成熟所必需（
Cell Res
2015
）。值得一提的是，有关MIWI的代谢异常造成精子细胞发育受阻的研究，为精子形成异常导致的男性不育症发生提供了潜在的分子信息。
2013年刘默芳研究员课题组与王恩多院士课题组合作在
Dev Cell
杂志上揭示了
piRNA通过泛素-蛋白酶小体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，并首次揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能
而
刘默芳研究组这篇最新的
Cell
论文在此前相关研究的基础之上，发现了无精/少弱精症患者存在拮抗人PIWI（HIWI）泛素修饰的基因突变，通过小鼠模型证明此类突变导致雄性不育，并深入揭示了其致病的分子机制。
此前在许多研究PIWI的动物模型中都证明了PIWI对生殖细胞发育的分化的重要作用，然而PIWI在人类生殖细胞发育分化中的功能并不清楚。那么作者首先提出的科学问题就是，
PIWI在人类生殖细胞形成中具有什么作用？人类不育患者中是否存在PIWI突变
？为了回答上述问题，作者首先检测了413例无精症患者（300例健康人群作为对照）
Piwi
基因（人类中又称为
Hiwi
）上一个在脊椎动物中十分保守的D-Box序列中是否存在突变。
测序结果显示，该课题组非常幸运地发现了3例无精症患者身上存在
Piwi
D-Box突变（
下图
）
。生化实验检测发现这类突变导致了PIWI蛋白泛素化缺陷，但是不影响PIWI对靶RNA分子的切割作用以及piRNA-loading的功能。
图为测序检测到的
3例无精症患者身上存在
Piwi
D-Box突变
为了进一步验证确实是
Piwi
D-Box突变是否确实可以导致的男性不育症的发生，那么接下来就很有必要构建条件性
Piwi
D-Box突变knock-in小鼠模型，小鼠模型显示
条件性
Piwi
D-Box
knock-in
突变后，小鼠出现雄性不育、精子形态异常以及细胞核结构疏松（
下图
）
。随后通过质谱检测发现，条件性
Piwi
D-Box
knock-in小鼠
精子中还存在多种蛋白异常表达。
图为正常雄性小鼠精子和
Piwi
D-Box
knock-in小鼠
精子形态上的差异
了解精子发育过程的人们应该知道，精子发育在结构特化的过程中会发生“
组蛋白-鱼精蛋白转换（Histone-to-Protamine exchange）
”（
下图
）。
2010年，
Dev Cell
杂志报道了RNF8介导的组蛋白泛素化启动了精子变形过程中的
“
组蛋白-鱼精蛋白转换
”（
下图
）。
有了上述研究背景，作者马上就想到检测小鼠精子中组蛋白泛素化修饰是否发生了变化。果然，
条件性
Piwi
D-Box
knock-in小鼠的后期
精子细胞中组蛋白泛素化水平显著下降（
下图
）。
Piwi
D-Box
knock-in小鼠
精子中组蛋白H2B泛素化水平大幅下降
然而上述这个过程中的分子机制又是什么呢？随后的生化实验表明，MIWI（PIWI）可以与RNF8相互作用，抑制了RNF8入核泛素化组蛋白。
Piwi
D-Box突变不仅导致MIWI突变体蛋白在细胞质中的累积，而且抑制了RNF8泛素连接酶入核，从而影响精子发生过程中组蛋白的泛素化以及进一步的“
组蛋白-鱼精蛋白替换
”过程
。
进一步实验表明RNF8-N（N端1-210aa）足以竞争RNF8全长蛋白和MIWI的结合作用。
好玩的是，在
Piwi
D-Box突变的精子中过表达
RNF8-N可以rescue精子的活力
（
下图
）。
总的来说，这项研究的重要意义在于首次发现人类
Piwi
基因突变可导致男性不育，深入揭示了其致病机理，并为相关男性不育症的精准医疗提供了理论基础和方法策略。
工作模型
专家点评：
陈大华
（中科院动物所研究员，国家“杰青”，中国科学院大学教授，“长江学者”）
Comments
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模式动物（如果蝇和小鼠）的研究表明，Piwi家族蛋白在调控piRNA的生物发生、转座子沉默以及生殖细胞的发育发挥重要作用。刘默芳研究组前期工作（
Dev Cell
, 2013）发现生殖细胞中MIWI蛋白的稳定性，通过其D-box受到APC/C复合物的严格调控。该研究在前期工作基础上，通过对男性先天无精症患者的筛查以及动物模型的分析，意外的发现了PIWI蛋白的新功能：D-box突变不仅导致MIWI突变体蛋白在细胞质中的累积，而且抑制了RNF8泛素连接酶入核，从而影响精子发生过程中组蛋白的泛素化以及进一步的组蛋白-鱼精蛋白的替换过程。有趣的是，通过抑制MIWI与RNF8之间的结合可以挽救这一突变精子的活力。
该项研究不仅诠释了PIWI蛋白在调控精子发生中的新机制，同时也为HIWI突变-相关男性不育临床治疗提供了新思路
