第一作者说+Plus深读 | Mol Cell 2016最佳技术: DNA甲基化分析技术Nano-hmC-Seal

5hmC (5-hydroxymethylcytosine, 5羟甲基胞嘧啶) 是近年来新发现的一种DNA修饰方式。在此之前，DNA的甲基化修饰（5mC）一直是最受关注的表观遗传因子，它可以通过抑制基因表达而在多种生物学过程中发挥重要的调控作用。然而，近年来的研究发现，5mC的作用只是DNA表观遗传动态调控中的一小步。在TET家族蛋白的作用下，5mC首先被氧化成5hmC,并进而氧化为5fC (5-甲酰胞嘧啶)和5caC(5-羧基胞嘧啶)，并最终在TDG蛋白的作用下转化为无修饰的普通胞嘧啶。这条TET和TDG介导的去甲基化通路调控了基因的重新活化和表达。如下图所示（图1，Tsagaratou et al., 2017)。

图1  TET蛋白控制的DNA去甲基化通路

5hmC作为DNA去甲基化的第一步，在哺乳动物的组织或细胞类型中广泛分布。越来越多的研究表明，5hmC不仅是DNA去甲基化的中间产物，而是直接参与基因转录调控，影响胚胎干细胞维持和分化、正常造血作用以及受精卵发育等重要生物学过程(Song et al.,2012)；并在人类疾病和肿瘤的发生发展过程中扮演重要的角色。

5hmC作为一种表观遗传修饰因子，研究其生物学功能的重要手段一般是高通量测序技术和功能基因组学分析。为了获得5hmC在基因组的分布信息，研究者们首先想到的是采用类似ChIP-Seq的方法：利用针对5hmC的抗体，捕捉带有5hmC的DNA片段并进行测序分析。然而，这种基于抗体的方法有着诸多的先天不足，包括较高的背景噪音，较差的可重复性和一定的序列偏好性等，这些因素都会对数据的分析结果造成干扰(Song et al.,2012)。

为了克服这些问题，芝加哥大学何川教授的研究团队开发了一种5hmC特异性的化学标记技术。该技术利用噬菌体的β-葡糖基转移酶（βGT），将含有叠氮基的葡萄糖基转移至5hmC，得到N3-5-gmC；之后再通过Huisgen cycloaddition反应(click chemistry)，将生物素标签安装在叠氮基上；再进一步利用生物素-亲和素系统捕捉带有5hmC的DNA片段。这种捕捉技术比传统的5hmC抗体捕捉技术的亲和性要高4个数量级以上，且在灵敏性和可重复性上都有极其可观的提高。基于这种化学标记方法，何川教授进一步地开发了hmC-Seal(cite 21151123)和TAB-Seq(cite 22608086)两种5hmC测序技术，并被广泛用于5hmC生物学功能的研究中。

随着近年来研究的深入，5hmC的重要性日渐突显。当前研究的重点也从细胞生物学功能转向研究5hmC在发育过程、疾病乃至肿瘤中所扮演的角色。然而，上述两种方法都需要大量细胞(>1,000,000)，远远超出了多数动物模型以及临床样本所能提供的细胞数。因此，学术界迫切需要一种可用于珍贵样本的，纳克级DNA的5hmC全基因组测序技术。

为了解决上述问题，笔者在何川教授课题组从事博士后期间，开发了一种新型的hmC测序技术：Nano-hmC-Seal。该技术可以对低至1,000个细胞 (纳克级DNA) 的样本绘制全基因组5hmC图谱。接下来简单介绍该方法的原理：

1. Tagmentation 我们采用了基于Tn5转座酶建立文库的策略(Adey et al., 2010; Buenrostro et al., 2013;Schmidl et al., 2015)，利用转座酶将基因组DNA打断成300-500bp长度的片段。 (Adey et al.,2010)

2. DNA fragments Tagmentation之后，转座酶会在DNA片段两端加上adaptor接头，可用于之后的建库PCR扩增。

3. Selective label这里我们采用已发展成熟的5hmC选择性化学标记策略。如前所述，该策略是一种高效的、无偏性的、全基因组范围的5mC标记方法(Song et al., 2011, 2012). 具体来说，使用T4噬菌体β-葡糖基转移酶（bGT），将含有叠氮基的工程葡萄糖部分转移至双链DNA中的5hmC上，得到b -6-叠氮基-葡糖基-5-羟甲基-胞嘧啶（N3-5-gmC）。

4. Click chemistry 通过Huisgen 环加成 (click)化学，生成一个稳定的五元环，同时将生物素(Biotin)标签安装在叠氮基上。

5. Pull down 最后，通过亲和素(avidin)磁珠，从基因组DNA片段中捕获含生物素标签的包含5hmC的DNA片段。

6. 常规PCR扩增反应产生文库，然后进行高通量测序。（图2A）

图2 (A)  Nano-hmC-Seal方法的原理图示

为证实该方法的可行性和稳定性，我们使用该技术检测小鼠胚胎干细胞(mESCs)的5hmC基因组分布。将从1000个mESCs分离出的基因组DNA(约5-6ng)检测的5hmC分布与5ng、50ng  DNA产生的Nano-hmC-Seal以及10μg DNA产生的 hmC-Seal profiling进行对比，得到了相似的结果（见图2B）。 

图2 (B) 在30kb区域5hmC信号检测，使用基因组浏览器

同时，5hmC的分布在各个重复样本中具有高度可重复性，见图2C。

图2(C) 散点图代表了各个样本之间的相关程度

为了验证Nano-hmC-Seal的优势和实用性，我们首先应用该技术绘制了造血干细胞(hematopoietic stem cell ，HSC)向祖细胞群(progenitor cell populations)分化过程中5hmC的动态分布图谱。我们发现5hmC富集在高表达基因的基因体中，并且5hmC的水平与标记活性转录的组蛋白修饰具有正相关性。进一步研究发现，小鼠的造血干细胞(HSCs)到祖细胞的分化与5hmC模式的动态变化有很强的关联性，谱系特异性的增强子被明显的5hmC峰标记。

1.Nano-hmC-Seal 揭示了在早期造血分化过程中增强子部位的动态羟甲基化位点

图 3. 使用Nano-hmC-Seal技术研究在早期造血过程中动态5hmC图谱

图3A是干细胞分化示意图，我们利用流式分选从小鼠骨髓中分离出约5000个相应细胞进行研究，包括造血干细胞(LSK),髓样干细胞 (CMP), 粒细胞-巨噬细胞祖细胞 (GMP), 和巨核细胞红系祖细胞(MEP)。如图3B所示， 在同一细胞系的多次三次重复样本中，5hmC的信号分布高度相似，表明了这种方法高度的可重复性。同时，我们发现在HSC分化过程中发挥关键作用的基因上，发现5hmC的分布出现了明显的变化。如图3C所示，例如，在GMP中，Cebpe基因的5hmC具有很高的含量；对比而言，Klf1基因，在细胞分化为MEP时出现了5hmC含量的增加。同时，我们测得的5hmC的富集区与造血细胞中的增强子(enhancer)具有很强的共定位。进一步的研究表明在血细胞生成中，增强子的活性变化与5hmC的动态变化是一致的。如图3D, 在血细胞生成各阶段普遍开放的增强子(common enhancer)中，5hmC信号在这几种细胞中的分布是相似的；然而髓系特异性增强子中，5hmC信号在LSK分化为CMP直至GMP这一过程中逐步增强，而在MEP细胞中却几乎消失；相应的，在红系特异性增强子中，5hmC信号在MEP中高度富集，表明5hmC分布与谱系定向有极强的关联性。更进一步的分析也确认，这些细胞中5hmC信号并没有富集在T细胞或NK细胞中的增强子。

2.小鼠白血病干细胞Tet2缺失与Flt3^ITD突变的Nano-hmC-Seal分析

在发现5hmC造血干细胞分化过程中的动态变化后，我们接下来使用Nano-hmC-Seal技术来研究5hmC与血液类疾病的关系。通过与Memorial Sloan-Kettering癌症研究中心的Ross L. Levine实验室合作,我们找到了一种理想急性髓系白血病（AML）小鼠模型。该模型包含5hmC的氧化酶Tet2以及酪氨酸激酶Flt3^ITD（T2F3）两种突变。这种小鼠的多能祖细胞(MPP)具有白血病干细胞的特性。我们从野生型小鼠和T2F3小鼠分别分离出MPP与GMP，并进行5hmC分析。在图4A中，我们可以看到，5hmC富集区无监督的分层聚类证明了，白血病T2F3样本与野生型样本在两种细胞中，均有明显的差异。为了找出在T2F3样本与野生型样本存在5hmC差异的特异性位点，我们继续鉴别了数千个5hmC差异区域 (differentially hydroxymethylated regions , DhMRs)。

图 4. Nano-hmC-Seal揭示5hmC在小鼠 AML模型的分布

我们将MPP中的DhMR与GMP中鉴定的DhMR进行比较，发现这两种细胞类型之间大多数（> 80％）不共享DhMR。这表明在从这种AML模型分离的这两种细胞类型中存在明显的5hmC沉积和维持。MPP中5hmC增加的区域优先与骨髓特异性增强子重叠，而MPP中的5hmC缺失区域富集红细胞相关增强子，如图4D所示。这些结果表明，5hmC分布的改变可能导致MPP向骨髓细胞异常分化。这一结论与之前在T2F3小鼠中GMP增加而MEP降低的观察结果一致。我们进一步在这些区域进行了motif分析，发现GATA和MYB等转录因子结合位点（图4E）。而这些转录因子的异常调控在AML发病机制中扮演重要角色。随后我们还对相同的细胞进行了RNA-seq分析，结果表明5hmC变化亦引起了基因表达的变化。

我们的研究工作为在体内疾病模型和有限的临床样本中检测DNA 5hmC提供了一种有效的全基因组检测方法，在癌症机理的研究以及临床应用上都具有重要的价值。具体而言，此方法在如下的几个领域具有广阔的应用前景。

1.5hmC在癌症机理的研究方面具有重要的意义

近年来的研究表明，5hmC含量及分布的改变在多种肿瘤细胞中广泛存在，对这一现象的深入研究对于揭示癌症发生发展的机理具有重要价值。而我们根据高度敏感的选择性化学标记和捕获方法开发的Nano-hmC-Seal技术可以提供在体内疾病模型检测DNA甲基化动态支持。帮助研究所和医疗机构对临床活检组织等珍稀样本进行5hmC的全基因组检测，以开展相应的肿瘤表观基因组学研究。

2.癌症早期诊断和临床应用

这项5hmC检测技术可以有效地鉴别癌症与正常组织间的差异。应用此技术检测肿瘤患者DNA中5hmC含量和分布可有效区分癌症患者和健康人群，并进一步地应用于癌症的早期诊断，癌症分型并为治疗用药提供指导。此外，这项技术亦可用于检测Cell-free DNA中的5hmC分布，实现对肿瘤病人的“液体活检”；为利用5hmC信息进行肿瘤无创筛查、预后评估、复发监控等临床应用提供可能。

 结语

 参考文献

1. Tsagaratou, Ageliki, et al. "TET Methylcytosine Oxidases in T Cell and B Cell Development and Function." Frontiers in Immunology 8 (2017).

2. Song, Chun Xiao, C. Yi, and C. He. Nature Biotechnology (2012).

3. Adey, A., Morrison, H.G., Asan, Xun, X., Kitzman, J.O., Turner, E.H., Stackhouse, B., MacKenzie, A.P., Caruccio, N.C., Zhang, X., and Shendure, J. (2010). Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome Biol. 11, R119. 

4. Song, C.X., Szulwach, K.E., Fu, Y., Dai, Q., Yi, C., Li, X., Li, Y., Chen, C.H., Zhang, W., Jian, X., et al. (2011). Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68–72. 

5. Song, C.X., Yi, C., and He, C. (2012). Mapping recently identified nucleotide variants in the genome and transcriptome. Nat. Biotechnol. 30, 1107–1116.

6. Song, C.X., Szulwach, K.E., Dai, Q., Fu, Y., Mao, S.Q., Lin, L., Street, C., Li, Y., Poidevin, M., Wu, H., et al. (2013). Genome-wide profiling of 5-formylcytosine reveals its roles in epigenetic priming. Cell 153, 678–691.