去甲肾上腺素转运蛋白的转运和抑制机制
去甲肾上腺素在中枢和周围神经系统中作为神经递质发挥关键作用，影响疼痛感知、睡眠-觉醒周期、觉醒、注意力、进食行为和战斗或逃跑反应等基本功能。去甲肾上腺素转运蛋白 (NET) 在回收突触前末端的去甲肾上腺素、终止其作用中起着不可或缺的作用。NET 是单胺转运蛋白 (MAT) 家族的成员，该家族利用 Na
+
梯度驱动去甲肾上腺素的跨膜运输。NET 与多种神经精神疾病相关，如抑郁症、注意力缺陷多动障碍和疼痛。尽管对类似转运蛋白（如 SERT 和 DAT）的研究已有进展，但 NET 的配体识别、离子结合和构象变化等机制仍不清楚。χ-芋螺毒素MrlA (χ-MrlA) 是一种选择性 NET 抑制剂，其作用机制尚待深入研究。安非他酮是临床批准的用于治疗抑郁症的 NET 和 DAT 抑制剂，它能恢复某些疾病相关的折叠缺陷突变体的功能。然而，安非他酮与 NET 的结合模式和抑制机制尚未得到充分探讨。
在这里，
中国科学院生物物理研究所
赵岩研究员
团队联合
哥本哈根大学
Claus J. Loland教授
共同展示了NET在apo状态和与去甲肾上腺素（或χ-MrlAEM、安非他酮、齐拉西酮）结合时的高分辨率复合结构，揭示了去甲肾上腺素的结合模式和Na
+
、Cl
−
配位在构象变化中的显著变化。χ-MrlAEM的结合提供了关于芋螺毒素如何变构结合和抑制NET的见解，而安非他酮和齐拉西酮则能将NET稳定在向内状态，但它们的结合袋不同。这些结构解析了NET中控制神经递质转运和非竞争性抑制的机制，为未来药物设计提供了蓝图。
相关成果以“Transport and inhibition mechanisms of the human noradrenaline transporter”为题发表在《Nature》上，第一作者为
Tuo Hu, Zhuoya Yu
和
Jun Zhao
为共同一作。
NET的功能分析与结构
为了深入了解NET的运输和调节机制，作者制备了全长野生型NET (NETWT)，但发现其在洗涤剂中易聚集。通过去除前51个非结构化N端残基，生成了稳定性更高的变体NETEM，其SEC谱更清晰。NETEM对去甲肾上腺素的Km值及对χ-MrlAEM、安非他酮和齐拉西酮的IC50值与NETWT相似，表明N端截断对功能无显著影响。
NETEM在脑极性脂质和支架蛋白MSP1D1E3环境中被重构为纳米盘，保留了运输功能。药物抑制实验显示，这些纳米盘样品能够有效结合药物。
作者还解析了NETEM在apo状态及药物存在下的结构，分辨率为2.6 Å至3.2 Å（图1a），并观察到N-糖基化位点及C端区域的详细结构（图1b）。这些结果为NET的功能研究提供了重要的结构基础。
NET 基材识别
作者以 2.6 Å 的分辨率确定了去甲肾上腺素结合的 NET 复合物 (NETNA) 的结构，并捕捉到了向内的构象状态（图1c, d）。冷冻电镜图像显示去甲肾上腺素在两个位置结合：S1和S2。S1位点的去甲肾上腺素通过静电相互作用和氢键与特定的残基结合，而S2位点则通过盐桥和氢键与其他残基相互作用（图1e）。这些位点在NETNA和NETApo结构中的残基构象相似，表明去甲肾上腺素的结合模式高度保守。一些突变如D75N和E382Q显著影响了NET的运输能力，表明这些位点对NET功能至关重要（图1f, g）。此外，与NET的S2位点相比，SERT的相应位点中缺少特定的残基，解释了NET的独特底物结合能力。
图 1：apo 和去甲肾上腺素结合 NET 的向内开放构象的冷冻电镜结构
χ-MrlA 的变构抑制
作者以2.8 Å的分辨率解析了与χ-MrlAEM结合的NET（NETMrIA）的结构，χ-MrlAEM是NET的高效非竞争性抑制剂（图2c）。冷冻电镜图像显示χ-MrlAEM以发夹形态与NET结合，阻止底物进入中央结合腔（图2d）。主要结合残基如K9、R12和MeY8通过静电和疏水相互作用稳定抑制剂的结合（图2f, g）。NETMrIA和NETNA的结构比较显示，χ-MrlA与去甲肾上腺素的结合袋不重叠，支持其作为非竞争性抑制剂的作用。突变分析进一步表明L469和T470位点对χ-MrlAEM的抑制效果至关重要，这解释了其对NET的特异性（图2i）。
图 2：NET 中 χ-MrlAEM 的变构结合位点
NET的构象转变
在NETNA和NETMrlA的不同构象状态下，支架结构域的排列一致，而其他跨膜螺旋和环则表现出显著位移（图3a）。
NETNA的TM1b和TM6a细胞外端倾斜，使得这些螺旋阻挡了通往中央结合袋的细胞外通道；TM1a则远离支架结构域倾斜，打开细胞内腔以释放底物（图3a）。TM1在这两种状态之间经历了180°的旋转（图3b）
。此外，跨膜螺旋和细胞外环的重排导致去甲肾上腺素的S2结合位点的形成（图3c）。高分辨率冷冻电镜图像还揭示了Na+和Cl-离子的结合位点及其在NET功能中的关键作用，特别是在不同状态下离子配位数的变化。Na2可能与转运蛋白的向内构象转变有关。
图 3：跨功能状态的构象转变
安非他酮对 NET 功能的抑制
安非他酮（图4a）作为选择性NET和DAT抑制剂，对SERT无效 。2.8 Å的NETBPP复合体结构显示，安非他酮的叔丁基胺基团深入结合腔，与A145TM3、V148TM3、Y152TM3等残基形成疏水相互作用，而D75TM6通过氢键稳定该分子（图4c, d）。
与去甲肾上腺素的结合模式不同，安非他酮的叔丁基胺基团延伸至细胞内路径，阻碍NET从向内到向外的构象转变
（图4f, g）。对比SERT与NETBPP的结构，发现SERT中G422的丙氨酸取代可能与安非他酮的叔丁基胺基团产生空间冲突，这可能解释SERT对安非他酮的不敏感性（图4h）。此外，SERT中TM8的局部位移可能由广泛的氨基酸变化引起，进一步影响安非他酮的结合。
图 4：安非他酮抑制 NET 的机制
齐拉西酮结合位点的识别
齐拉西酮作为辅助治疗用于重度抑郁症，通过抑制去甲肾上腺素和血清素的摄取。作者以3.2 Å的分辨率解析了齐拉西酮与NET的复合物结构，
显示齐拉西酮结合在由TM2、TM6b、TM7和TM8形成的空腔内，与D75TM1形成氢键，并与A145TM3等残基建立广泛的疏水相互作用（图5a-d）
。V325突变为亮氨酸后IC50显著增加，说明齐拉西酮与该位点的空间冲突（图5e）。结构比较显示齐拉西酮的结合位点与SERT中的位置不同，且其较小的乙烷基团较易于适应SERT的较窄空间，这解释了其与安非他酮不同的选择性。
