细胞因子在免疫系统中介导细胞间通讯，并且代表着重要的治疗靶点。大量的研究已经突显了它们在免疫功能中的核心作用，然而目前仍缺乏对免疫细胞类型对细胞因子的细胞反应的全局视角。今天小编带来2023年12月，Nature发表的高分研究，作者创建了一部细胞因子和免疫细胞之间的“词典”，该词典为细胞因子功能生成了新的假设，阐明了细胞因子的多效性作用，扩展了我们对每种免疫细胞类型激活状态的认识，并提供了一个框架，以推断特定细胞因子和细胞间通讯网络在任何免疫反应中的作用。
免疫词典如何构建？
1、将新鲜再制备的无载体细胞因子或磷酸盐缓冲液（PBS作为对照）注射到野生型C57BL/6小鼠的腹侧皮肤下，每种细胞因子每组三只独立的重复小鼠。在注射后4小时收集了小鼠皮肤引流淋巴结，进行单细胞测序。2、共鉴定出了20多种细胞类型。这些细胞类型包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、调节性T细胞（Treg）、自然杀伤细胞（NK细胞）、固有淋巴细胞（ILC）、浆细胞样树突状细胞（pDC）、常规树突状细胞1型（cDC1）、cDC2、迁移性树突状细胞（MigDC）、朗格汉斯细胞、胸腺外Aire表达细胞（eTAC）、巨噬细胞（Marco+或Lyz1+）、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞，以及少量其他较少见的细胞类型，包括嗜碱性粒细胞、血管内皮细胞（BEC）、淋巴管内皮细胞（LEC）和纤维网状细胞（FRC）。3、大多数细胞类型在刺激后保持稳定，但显著的例外是在某些细胞因子处理后，淋巴结中单核细胞的比例显著增加。计算每种细胞类型对细胞因子处理中显著差异表达的基因（DEGs）。平均每种细胞因子-细胞类型组合鉴定了51个DEGs，并且对细胞因子作出反应的DEGs中，大多数（72%）是上调而不是下调的。作者还确认了对已建立的细胞因子响应基因的强烈上调，例如TNF的Tnfaip3、IL-4的Il4i1以及对IFNβ的Isg15和其他干扰素刺激基因（ISGs）的反应。4、为了绘制免疫细胞对每种细胞因子的响应，作者创建了一张图，量化了每种细胞类型在细胞因子处理和PBS处理细胞之间的全局转录组变化（图1d）。这张图捕捉到了细胞因子的已知细胞靶标，例如NK细胞对IL-2、IL-12、IL-15和IL-18的响应。某些细胞因子，如IFNα1、IFNβ、IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-36α、IL-15和TNF，在几乎所有细胞类型中诱导了基因表达的强烈变化。一些细胞因子偏好于靶向一个谱系（例如，IL-21影响淋巴谱系，而IL-3影响髓系谱系）或一组细胞类型。每个主要免疫细胞类型对每个主要细胞因子的转录组反应构成了一本体内免疫反应词典，称之为免疫词典。
图1.超过17种免疫细胞类型中响应86种细胞因子的单细胞转录谱字典作者对这个词典进行以细胞因子为中心的分析，探讨不同细胞类型如何对同一种细胞因子做出反应。基因表达热图显示，细胞因子诱导了特定于细胞类型的基因表达变化（图2a）。作者计算了对特定细胞类型专有或在多个细胞类型之间共享的上调基因的数量（图2b）。无论如何定义DEGs的阈值，对于特定细胞因子的大多数上调基因都是特定于一个细胞类型的。一些细胞因子在一个或少数几个细胞类型上诱导了显著的变化，比如IL-18对NK细胞的影响、IL-3对pDCs的影响以及GM-CSF对MigDCs的影响。最常见的DEGs是对于IFNα1和IFNβ（跨越所有细胞类型）、IL-4（跨越几种细胞类型的组合）以及IL-2、IL-15和IL-18（这三种细胞因子在CD8+T细胞和NK细胞中诱导了细胞毒性基因）。作者确定了由共同表达的基因组成的基因程序（GPs），这些基因在细胞因子刺激下作为一个群体上调（图2c）。IFNα1和IFNβ作为相关的细胞因子，彼此诱导了高度相似的响应，正如IL-1α和IL-1β一样。IFNα1和IFNβ在几乎所有细胞类型中诱导了共同的抗病毒基因程序，但也有一些谱系特异性和细胞类型特异性的程序。相比之下，作为多种已知功能的促炎细胞因子，IL-1α和IL-1β诱导了高度特异于细胞类型的基因程序，并且富集了多样的生物学过程（图2c）。这些基因程序似乎增强了几种细胞类型的已知功能，包括：（1）中性粒细胞上调化学因子和炎症基因；（2）MigDCs和朗格汉斯细胞上调迁移程序；以及（3）Treg细胞诱导Hif1a和Ctla4，可以介导免疫抑制。以上结果说明了类型I干扰素响应包括一个共同且自主的抗病毒防御程序，而IL-1α和IL-1β则触发了一个由高度特异于细胞类型的功能组成的协调的多细胞反应。总之，以细胞因子为中心的分析中，作者对不同细胞类型如何对每种细胞因子做出反应进行系统分析，提供了观察到的细胞因子的多效作用的分子图谱。
作者接下来对词典进行了以细胞类型为中心的分析，以确定细胞因子诱导的细胞状态。细胞因子是免疫细胞极化的主要驱动因素，一个经典的例子是不同的细胞因子将巨噬细胞转化为促炎M1型或修复性M2型状态。然而，许多免疫细胞类型的极化状态尚未全面表征，甚至巨噬细胞的极化状态也比M1/M2的二分法更为复杂。基因表达谱可以同时测量整个转录组，并且在定义环境信号驱动的细胞状态方面特别有用。在这里，作者利用该词典系统地识别了单一细胞因子诱导的细胞极化状态。对每种免疫细胞类型进行了亚聚类，并定义了66个主要的极化状态，这些状态作为亚聚类显著富集了相对于PBS处理细胞而言的细胞因子处理细胞，并且表达了有意义的生物学程序。每个极化状态由一个或少数几个主要的细胞因子驱动（图3a-n）。作者检查了巨噬细胞和单核细胞，以查看这种方法是否揭示了先前研究建立的极化状态。如预期的那样，IFNγ诱导了一个称为“Mac-b”的状态，该状态过度表达了M1相关的促炎基因（例如，Cxcl9和Cxcl10）。IL-4和IL-13诱导了一个独特的“Mac-e”状态，该状态不以这些促炎基因为标志，而是以Chchd10、Glrx和Retnla为特征。NK细胞以其细胞毒功能而闻名，但其他功能仍在不断发现中。IL-2、IL-12和IL-15诱导了一个表达细胞毒基因增加的状态，而I型干扰素诱导了细胞毒基因和ISG的表达。IL-1α和IL-1β诱导了一个独特的“NK-c”状态，与其他NK细胞状态低相关，并且缺乏细胞毒分子的过度表达。然而，在这种状态下，Ifngr1被上调，这可能增强了NK细胞对IFNγ的激活。在“NK-f”状态下，IL-18激活的NK细胞显示出与由IL-2、IL-12或IL-15激活的NK细胞明显不同的特性。IL-18触发了1000多个基因的上调，比用其他细胞因子刺激的细胞高出一个数量级。与PBS处理相比，IL-18诱导的状态在生物合成过程中得到了明显丰富，包括Myc的诱导（控制生长和增殖）、免疫过程，如髓系细胞的成熟（编码GM-CSF的Csf2）、DC的招募（Xcl1）、细胞毒性（Gzmb）和分化调节因子（Kit和Batf）。IL-18在癌症免疫治疗的临床前研究中表现出了希望，并且可以激活T细胞、NK细胞和其他细胞类型。IL-18对NK细胞的这种独特且强烈的反应表明了IL-18-NK细胞轴在免疫系统中的多功能作用。B细胞被IL-4极化为一个独特的Il4i1+状态，并且通过CD40L或IL-21极化为增殖表型。与它们对NK细胞的影响类似，IL-1α和IL-1β在T细胞亚群中诱导了Ifngr1的上调。γδ T细胞表现出多样的极化状态，包括由IL-23诱导的一个独特的“Tgd-f”状态，该状态过度表达Il22，并由TNF、TL1A或IL-17E诱导的一个“Tgd-d”状态，该状态过度表达Odc1。尽管先前关于淋巴细胞分化状态的研究都是在TCR或BCR刺激的背景下进行的，但作者的发现表明，静止的淋巴结B细胞和T细胞也可以被细胞因子极化，表达多样的基因程序。作者观察到MigDC和朗格汉斯细胞中存在共享的极化状态和细胞因子驱动因子（图3j，k）。TNF独特地增加了在由Cd40和Ccl22表达标记的状态中的细胞比例，从而可能通过CCR4–CCL22轴增强抗原呈递并与T细胞的相互作用。IL-1α和IL-1β增加了Ccr7的表达，GM-CSF和IL-1家族细胞因子诱导了/r4a3的上调，后者在DC迁移中起关键作用。这些结果表明，TNF可能会触发局部炎症和DC-T细胞相互作用，并且IL-1家族细胞因子可以促进DC迁移，从而在淋巴结中激活T细胞应答。总之，以细胞类型为中心的分析中，作者对细胞因子驱动的细胞极化状态的参考图表显示了所有免疫细胞类型的可塑性。这些极化状态可能在细胞类型之间共享，或者特定于一种细胞类型。
图3. 细胞因子驱动每种细胞类型中不同的极化状态
为了更好地理解每种细胞类型进行的细胞间通信，作者通过量化跨所有基线和细胞因子刺激条件的对应转录水平来确定每种细胞因子的产生来源，以考虑刺激诱导的表达（图4a）。纤维网细胞（FRCs）表达最多种不同的细胞因子，与之前关于它们在各种免疫和非免疫组织中的异质性和维持功能的发现一致。淋巴结中的其他稀有细胞类型，如嗜碱细胞和ILCs，也表达了大量细胞因子。一个免疫细胞类型的丰度与该细胞类型产生的细胞因子数量之间存在负相关关系，细胞因子的产生利用相同数量的细胞来计算以确保可比性（图4b）。这些发现对不同分析参数值都很稳健，表明尽管数量较少，但较为罕见的细胞类型在免疫细胞间通信网络中起着至关重要的作用。
基于推断的细胞因子产生水平，作者构建了一个细胞间相互作用图，绘制了免疫系统中可用的细胞间通信通道。数据表明，FRCs可以通过大量产生的细胞因子影响几乎每一种细胞类型（图4c，左）。cDC1细胞也可以通过较少数量的细胞因子影响几乎所有细胞类型，其中最显著的是IL-1β，它影响了许多细胞（图4c，右）。网络的整体视图显示，大多数细胞类型可以通过至少一种细胞因子影响几乎每一种其他细胞类型，这表明免疫系统具有很高的互联性。此外，作者针对每种细胞类型创建了一个细胞因子-受体表达图。细胞因子处理诱导了细胞因子或受体表达的变化，例如，在cDC1细胞中，TNF和IFNβ会上调Cd40的表达，这可能使细胞对其他细胞因子的后续响应更加敏感。一些细胞因子即使在受体高度表达的情况下也会诱导反应，例如IL-1α和IL-1β影响T细胞、NK细胞和DCs（。这种效应可能是由于受体转录本的检测不敏感、细胞因子诱导的分子的快速二级效应或未知受体。总之，以上结果揭示了细胞在体内通过细胞因子网络相互作用的多种方式。
为了从任何转录组数据推断免疫细胞极化和细胞因子响应，作者创建了免疫反应丰度分析（IREA），它是免疫字典的配套软件。IREA实现了统计测试来评估转录组中细胞极化或细胞因子特征的丰度，然后可以用于推导解释观察到的免疫反应的细胞-细胞通讯网络。作者将IREA应用于一项发表的小鼠肿瘤中免疫细胞的单细胞转录组数据集，该数据集来自接受抗PD-1检查点阻断治疗的小鼠（图5c–e）。IREA自动推断出治疗后的单核细胞和巨噬细胞极化为IFNγ诱导的“Mac-b”（类似M1型）状态，并远离IL-4诱导的“Mac-e”状态，这与IFNγ极化的M1型巨噬细胞的已知抗肿瘤特性相符（图5c）。该方法使得可以连续地表征多个极化状态的免疫细胞，这与最近研究的观点一致，即免疫细胞不是二分极化的。在其他细胞类型中也发现了极化，包括NK细胞极化为细胞毒性的“NK-e”状态，这可以由IL-2、IL-12和IL-15诱导（图5c）。NK细胞富集了这些细胞因子的特征，而IL-12亚单位基因在DC和其他髓系细胞中表达（图5d、e），与IL-12在抗PD-1治疗中的已知作用一致。在86种细胞因子中，IREA发现免疫抑制性细胞因子TGFβ1在抗PD-1治疗细胞中的响应与未治疗细胞相比呈现最负相关的反应，这与其已知的在减弱PD-1和PD-L1阻断引起的免疫增强作用中的作用一致。肿瘤中的特定细胞类型产生并作用于这些和其他各种细胞因子，从而形成了对免疫治疗有效反应的细胞因子网络（图5d，e）。对于推断出的响应细胞因子，细胞表达了受体，但也对某些没有反应的细胞因子表达了受体，这突显了受体的存在不足以引发反应（图5d）。将IREA应用于严重的COVID-19感染显示出B细胞和T细胞在严重疾病中对细胞因子的反应，反映了调节淋巴细胞的血浆细胞因子的增加。因此，该框架能够推断出相关细胞反应的关键分泌因子（例如，图5c，d），并生成一个复杂免疫反应的分子模型的细胞-细胞相互作用（例如，图5e）。
图5. IREA能够基于转录组数据推断细胞因子活性、免疫细胞极化和细胞-细胞通信该研究创建了一个系统的细胞类型特异性的细胞因子反应字典，为了解细胞因子功能和推断任何免疫反应中的细胞-细胞通信网络提供了新的见解。如果各位小伙伴还在迷茫细胞因子以及各种免疫细胞的复杂关系，那查查这部词典吧！Ang Cui, et. Dictionary of immune responses to cytokines at single-cell resolution. Nature. 2024 Jan;625(7994):377-384. doi: 10.1038/s41586-023-06816-9. Epub 2023 Dec 6.
