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单细胞组学学术标杆，汤神是怎样炼成的？

生信人 · 公众号 · 生物 · 2025-04-03 07:03

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汤富酬教授 ，国际单细胞组学领域的开拓者与领航者，其学术生涯堪称中国生命科学领域的标杆性成长史。 1998 年本科毕业于北京大学， 2003 年获北京大学细胞生物学博士学位，随后赴英国剑桥大学 Gurdon 研究所从事博士后研究，师从发育生物学泰斗 Azim Surani 教授，深耕表观遗传学与干细胞领域。 2010 年，汤教授回国组建实验室，现任北京大学生物医学前沿创新中心（ BIOPIC ）教授、北京未来基因诊断高精尖创新中心副主任、北大 - 清华生命科学联合中心研究员，并担任 ”Cell Research””Genome Biology” 等顶级期刊编委，其学术影响力辐射全球。

汤教授以通讯作者在 ”Cell””Nature””Science” 等顶刊发表论文 70 余篇，被引超 2 万次，研究成果六度入选 “ 中国科学十大进展 ” 及 “ 中国生命科学十大进展 ” 。 2016 年获谈家桢生命科学创新奖， 2021 年荣膺第三届 “ 科学探索奖 ” ， 2024 年当选国际干细胞研究学会（ ISSCR ）会士，成为亚洲首位获此殊荣的科学家。

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自 2009 年单细胞转录组测序（ scRNA-seq ）技术初现雏形，汤富酬教授团队在单细胞多组学领域的探索便如星火燎原，不断突破技术边界。从单一转录组到基因组、表观组的多维度整合，从短读长测序到长读长技术的革新，汤教授团队的技术图谱不仅勾勒出单细胞组学的发展脉络，更为生命科学领域的研究提供了显微镜般的解析能力。以下按时间轴梳理其开发的组学新技术，窥见 “ 汤神 ” 炼成之路。如有遗漏，敬请补充。

1 、单组学奠基阶段（ 2009-2015 ）

2009 年：单细胞转录组测序的奠基之作

2009 年，汤教授团队在 ” mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell ” 中首次提出单细胞 mRNA 测序技术，通过改良逆转录和扩增流程，结合 SOLiD 测序平台，成功从单个小鼠胚胎细胞中捕获 5,270 个基因，远超微阵列技术的灵敏度，并鉴定出 1,753 个新剪接位点。此前，单细胞研究受限于样本量不足，而该技术首次实现了单细胞水平的高通量转录组分析，揭示了单个细胞中转录本异构体的复杂性（如 8-19% 的基因同时表达多个剪接变体）。技术验证了单细胞测序在胚胎发育（如 Dicer1/Ago2 缺陷卵母细胞的基因异常表达）和干细胞异质性研究中的潜力，为后续单细胞技术奠定了基础。

这一工作堪称单细胞组学的开山斧。其核心突破在于通过优化扩增效率降低技术噪音，将单细胞研究从定性推向定量。有趣的是，文中提到 “ 检测到比微阵列多 75% 的基因 ” ，这一对比暗示了传统技术的局限性，也为后续技术迭代埋下伏笔 —— 如何进一步提升覆盖度和准确性？

图 scRNA-seq 工作流程

2015 年：突破 poly(A) 限制，解锁环状 RNA

在 ” Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos ” 中，团队开发了随机引物锚定逆转录技术（ SUPeR-seq ），首次实现单细胞中 poly(A)+ 和 poly(A)- RNA （如环状 RNA ）的同时检测，灵敏度较传统方法提升 50% 。传统单细胞测序依赖 poly(A) 引物，遗漏了环状 RNA 等非编码 RNA 。 SUPeR-seq 不仅在小鼠胚胎中发现 2,891 个环状 RNA ，还鉴定出母源与合子基因的特异性表达模式。该文揭示了早期胚胎发育中环状 RNA 的动态变化，为非编码 RNA 功能研究提供新工具。

如果说 2009 年的技术是 “ 单细胞转录组 1.0” ， SUPeR-seq 则是 “2.0 升级版 ”—— 从 mRNA 扩展到全转录组。其巧妙之处在于用随机引物替代 oligo(dT) ，同时通过末端加 poly(A) 实现扩增兼容性。这一设计思路后来被许多长读长测序技术借鉴，例如 Oxford Nanopore 的 cDNA 测序流程。

图 SUPeR-seq 工作流程

2015 年：单细胞甲基化组测序技术的突破

15 年 4 月，汤富酬团队开发了一种单细胞甲基化组分析技术（ scRRBS ），通过将传统 RRBS 的多个步骤（细胞裂解、 MspI 酶切、末端修复 / 加 dA 尾、接头连接、亚硫酸盐转化）整合为单管反应，显著减少 DNA 损失（传统方法需 5 次纯化， scRRBS 仅 1 次）。该技术可在单个二倍体哺乳动物细胞中检测约 100 万个 CpG 位点（覆盖 70% 的 CpG 岛），单碱基分辨率下甲基化状态呈数字化（全甲基化或未甲基化）。尽管 scRRBS 覆盖的 CpG 总数少于单细胞全基因组亚硫酸盐测序（ scBS ），但其对 CpG 岛的捕获效率更高（ scBS 偏向 CpG 稀疏区），且数据一致性更强，两者形成互补。实验周期约 3 周，适用于胚胎、生殖细胞等珍贵样本。

该技术通过调整缓冲体系和反应体积，保留各步骤酶活性，避免中间纯化导致的 DNA 损失（如精子细胞仅需 1μl 裂解缓冲液）。此外，单个小鼠二倍体细胞可覆盖 40% 标准 RRBS 的 CpG 位点（使用数千细胞）， 5 个细胞可达 60% 。该技术成功应用于小鼠精子（单倍体甲基化全或无模式）和人类合子原核（父源基因组快速去甲基化）等珍贵样本，揭示了早期胚胎表观重编程的动态异质性。然而，其局限性包括依赖 MspI 酶导致的启动子 /CpG 岛偏向性覆盖、无法区分 5mC 与 5hmC 、单细胞间覆盖位点重叠率有限（尤其 scBS 更严重），以及低起始量下映射效率较低（单细胞仅 25% ）。此外，技术尚未适配微流控高通量平台，扩增步骤可能引入随机偏差，影响稀疏基因组区域的分析。

图 scRRBS 工作流程

该技术是单细胞表观组的 “ 探照灯 ” ，首次在单细胞层面系统解析 DNA 甲基化异质性，为发育生物学（如胚胎编程重设）、癌症（克隆演化）等研究提供工具。其单管整合思路启发后续微流控技术的开发，而数字化甲基化数据（全 / 无）则为单细胞表观模型的定量分析奠定基础。文中提到 “ 单个精子细胞检测到 1,753 个 CpG 位点 ” ，这一数据暗示技术灵敏度与生物学特性的精准对应 —— 如何在低起始量下平衡覆盖深度与准确性？这成为后续单细胞多组学整合的关键挑战。

2 、多组学整合阶段（ 2016-2019 ）

2016 年：单细胞三组学整合，解析肝癌异质性

在“ Single-cell triple omics sequencing reveals genetic, epigenetic, and transcriptomic heterogeneity in hepatocellular carcinomas ” 中，团队首创单细胞基因组（ CNV ）、表观组（ DNA 甲基化）和转录组的同步分析（ scTrio-seq ）。通过温和裂解分离细胞核与胞质 RNA ，分别进行 scRRBS （甲基化）和 scRNA-seq ，首次在肝癌单细胞中发现 CNV 与基因表达的强相关性，但 CNV 对甲基化影响微弱。本文揭示了肝癌细胞中遗传变异（如亚克隆 CNV ）、表观失调（启动子低甲基化）与转录异质性的多层互作，为肿瘤进化研究提供多组学视角。

scTrio-seq 是单细胞多组学的分水岭。其创新点在于物理分割细胞核与胞质，实现 “ 一细胞三组学 ” 。但技术挑战也不容忽视 —— 如何保证核内 DNA 与胞质 RNA 的完整性？文中提到 “ 核去除样本的基因表达相关性未受影响 ” ，暗示裂解条件的精细优化是关键。这一工作启发了后续的 “ 同一细胞多组学 ” 技术（如 DR-Seq 、 G&T-seq ）。

图 scTrio-seq 工作流程

2017 年：重复测序降噪音，精准捕捉胚胎异质性

在“ MR-seq: measuring a single cell's transcriptome repeatedly by RNA-seq ” 中，团队将单个细胞裂解液分为两份独立建库（ MR-seq ），通过重复测序量化技术噪音，首次实现仅需两个细胞即可鉴定差异表达基因。解决了单细胞测序因技术变异导致的假阳性问题，在小鼠 2/4/8 细胞期胚胎中发现数百个异质性基因（如 Tdgf1 、 Zscan4 ）。文章验证了早期胚胎细胞间的转录波动，为发育命运决定机制提供线索。

MR-seq 的核心理念是 “ 技术重复代替生物学重复 ” ，这一设计直击单细胞测序的痛点 —— 高噪音。其思路与后期流行的 UMI （唯一分子标识符）技术异曲同工，均通过冗余信息提升可靠性。但 MR-seq 成本较高，可能限制了其广泛应用，而 UMI 则成为更主流的解决方案。

2018 年：单细胞多组学整合技术的里程碑

在“ Single-cel multi-omics sequencing of human earlyembryos ”中，汤富酬团队开发了单细胞多组学技术（ scCOOL-seq ），实现同一细胞中 DNA 甲基化、染色质可及性、核小体定位及拷贝数变异的同步分析。该技术通过改进 NOMe-seq 与 PBAT-seq ，结合甲基化敏感酶 MspI 与 GpC 甲基转移酶处理，在人类早期胚胎中捕获染色质开放区域（如启动子、增强子）的甲基化动态，平均每个细胞覆盖 14,916 个启动子（ 59% ）和 16,688 个 CpG 岛（ 60% ）。研究揭示了人类父源基因组在合子阶段即呈现更开放的染色质状态（与小鼠相反），并维持至 4 细胞阶段；同时发现 DNA 甲基化异质性与染色质可及性异质性分别富集于不同功能基因（如前者富集炎症相关基因，后者富集染色质重塑基因）。

scCOOL-seq 的创新在于多组学整合设计：通过单次建库同步分析染色质状态与甲基化，并利用 SNP 分型追踪亲本基因组表观差异。其应用验证显示，人类胚胎中 35% 的开放启动子区域依赖转录活性维持（如抑制转录后 1,797/5,155 区域关闭），揭示了转录与染色质开放的反馈机制。然而，该技术局限性显著：不同组学（如甲基化与染色质可及性）的覆盖范围存在差异（启动子 /CpG 岛偏向性）、无法区分 5mC 与 5hmC ，且多组学数据整合复杂度高（需定制生信流程）。此外，实验依赖高质量单细胞分离，对胚胎操作技术要求苛刻，部分晚期胚胎细胞因脆弱性难以完整获取。

图 scCOOL-seq

scCOOL-seq 首次绘制人类早期胚胎多组学表观图谱，解析了父源基因组染色质快速开放的独特性（与小鼠物种差异），并揭示 DNA 甲基化与染色质重塑的协调与独立性。其发现“ ZGA 伴随全局染色质重构”为胚胎发育命运决定机制提供关键证据，而“ SVAs 等转座元件染色质开放与表达同步”暗示转座活性在胚胎发育中的潜在功能。该技术推动单细胞多组学从“数据叠加”迈向“机制互作”研究，为疾病（如癌症异质性）和发育生物学领域树立了新范式。

3 、长读长技术突破阶段（ 2020-2023 ）

2020 年：长读长测序解锁转录组 “ 暗物质 ”

在“ Single-cell RNA-sea analysis of mouse preimplantation embryos by third-generation sequencing ” 中，团队基于 Nanopore 平台开发单细胞全长转录组测序（ SCAN-seq ），读长可达 43 kb ，鉴定出小鼠胚胎中 27,250 个未注释转录本（如新型 lncRNA 和融合基因）。传统短读长技术无法解析复杂剪接变体，而 SCAN-seq 首次在单细胞水平捕获等位特异性表达和新型异构体，例如验证了 Sox2 基因的多个未报道外显子连接，并揭示了早期胚胎发育中转录组复杂性的冰山全貌。

SCAN-seq 是 “ 三代测序 + 单细胞 ” 的典范。其核心突破在于通过多重条形码（ 48 个细胞混合建库）解决单细胞 cDNA 量不足的问题。这一策略后来被 10x Genomics 的 Linked Reads 技术采用，但 SCAN-seq 更聚焦于全长转录本解析，为癌症融合基因和神经突触可变剪接研究开辟了新路径。

图 SCAN-seq 工作流程

2021 年：长读长基因组测序，捕捉结构变异

在“ SMOOTH-seq : single-cell genome sequencing of human cells on a third-generation sequencing platform ” 中，团队基于 PacBio HiFi 技术开发单细胞全基因组测序，通过 Tn5 转座酶片段化与长读长测序，首次在单个 K562 细胞中检测到染色体结构变异（ SVs ）和 ecDNA 。

传统 scWGS （如 MALBAC ）受限于短读长，难以解析 SVs 。 SMOOTH-seq 在白血病细胞中发现克隆特异性的大片段缺失（如染色体 7q/9q ），并揭示 ecDNA 的异质性分布，为肿瘤基因组不稳定性研究提供高分辨率工具。

图 SMOOTH-seq 工作流程

SMOOTH-seq 的亮点在于 “ 转座酶片段化 + 长读长 ” 的组合拳。转座酶随机切割降低了扩增偏好性，而 HiFi 测序则解决了长片段准确性难题。这一技术或将推动液体活检领域的发展 —— 例如从循环肿瘤细胞中直接捕获 ecDNA 驱动的耐药突变。

2022 年：染色质可及性与遗传变异的共舞

22 年 10 月，团队整合 ATAC-seq 与 Nanopore 测序，首次在单细胞中同步分析染色质开放区域（表观组）和结构变异（基因组），在 GM12878 细胞中鉴定出 CTCF 结合位点的单倍型特异性可及性（ scNanoATAC-seq ）。传统 scATAC-seq 无法解析 SV 对染色质结构的调控，而该技术发现 SVs 可能破坏增强子 - 启动子互作（如 CD19 基因座的缺失导致染色质可及性降低）。

结论：为遗传变异如何通过表观重塑影响疾病表型提供机制解释。

scNanoATAC-seq 的突破在于一石二鸟 —— 同时捕捉表观与遗传信息。其设计灵感可能源自 2016 年的 scTrio-seq ，但将多组学整合推向更高维度。未来或可结合 CRISPR 筛选，解析特定 SV 如何动态调控染色质状态。

图 scNanoATAC-seq 示意图

2023 年 1 月： SCAN-seq2—— 单细胞全长转录组的革命性突破

SCAN-seq2 基于第三代测序平台（ TGS ），通过引入双端条形码（ 3' 和 5' 端）实现单细胞高通量测序，单次运行可分析 3072 个细胞。其核心在于结合逆转录和 PCR 扩增优化，显著提升灵敏度和准确性，支持全长转录本的检测，包括复杂异构体和假基因表达。 SCAN-seq2 首次在单细胞水平实现高精度、高通量的全长转录组分析，解决了传统长读长测序灵敏度低和错误率高的问题。在 5472 个细胞中鉴定出数千种新型 RNA 异构体，揭示了假基因的细胞类型特异性表达，并精准解析了 T 细胞受体（ TCR ）和 B 细胞受体（ BCR ）的 V(D)J 重排事件。此外，在药物处理后观察到 HepG2 和 Hela 细胞凋亡的保守响应。

图 SCAN-seq2 工作流程

SCAN-seq2 不仅填补了长读长单细胞技术的空白，还为研究 RNA 剪接和基因调控网络提供了新工具。未来或可结合表观组学，探索转录异构体与染色质状态的关联。

2023 年 8 月： scNanoHi-C—— 单细胞高阶染色质互作的显微镜

通过纳米孔长读长测序（ ONT ）捕获单细胞内染色质的近端互作（ <200 nm ），结合 Tn5 片段化和组合条形码策略， scNanoHi-C 实现了基因组范围内多向互作的高效检测。首次在单细胞水平解析高阶染色质结构（如增强子 - 启动子多向互作），突破传统 Hi-C 的低分辨率限制。在 GM12878 细胞中鉴定出活跃染色质区域的多维互作网络，并发现不同细胞亚型的染色质结构异质性。 scNanoHi-C 为研究细胞命运决定中的染色质动态提供了利器。若与转录组（如 SCAN-seq2 ）整合，可揭示三维基因组结构与基因表达的时空关联。

图 scNanoHi-C 工作流程

2023 年 9 月： scNanoCOOL-seq—— 单细胞多组学整合的利刃

scNanoCOOL-seq 基于纳米孔测序，通过双硫键保护 DNA 甲基化信号，同时捕获基因组（ CNV/SV ）、 DNA 甲基化、染色质可及性和转录组信息。该技术实现了单细胞水平的长读长多组学联合分析，解决传统方法对长片段表观特征的盲区。在 HFF1 和 K562 细胞中，解析了等位特异性 DNA 甲基化（如印记控制区），并追踪了易位位点的表观状态。

图 scNanoCOOL-seq 工作流程

scNanoCOOL-seq 的 “ 一石多鸟 ” 策略为细胞异质性研究树立新标杆。未来或可引入蛋白质组学，构建更全面的单细胞多模态图谱。

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4 、临床转化与精准医学阶段（ 2023-2024 ）

2023 年 6 月：单精子基因组测序 —— 染色体范围单倍型定相的里程碑

由于读长的限制，目前基于短读长的单精子基因组测序方法只能实现 SNP 单倍型分析，在复杂基因组区域的结构变异（ SV ）检测和单倍型分析方面存在困难。为了克服这些限制，汤教授团队开发了一种基于长读长的单精子基因组测序方法和相应的数据分析流程，可以准确识别单精子中的交叉事件和染色体水平非整倍性，并有效检测单个精子细胞内的 SV 。该技术突破短读长技术对结构变异（ SV ）检测的局限，首次在无亲本数据支持下完成染色体级别的 SNP 和 SV 单倍型定相。在 100 个精子细胞中， SV 定相准确率达 98.59% ， SNP 定相达 99.95% ，并解析了串联重复（ STR/VNTR ）的等位特异性扩增。

该技术为遗传病研究和生殖医学提供了新视角，尤其是复杂 SVs 与疾病的关联。结合 SCAN-seq2 的转录组数据，可探索 SV 对基因表达的等位特异性影响。

2024 年 3 月： Refresh-seq—— 减数分裂重组的 “ 高清地图 ”

基于限制性内切酶切割和长读长测序，通过均等片段化同源染色体，显著降低等位基因丢失率（ ADO ），实现低深度下高精度检测交叉事件。首次在单精子 / 极体中绘制小鼠减数重组的高分辨率遗传图谱，揭示性别二态性。在 688 个精子中， SV 定相精度达 95% ，并发现雌雄配子重组热点的分布差异。

图 Refresh-seq 工作流程

Refresh-seq 为生殖遗传学提供了新工具，尤其是胚胎植入前遗传学诊断（ PGD ）。结合单精子测序技术，可深入研究重组异常与不孕症的关联。

2024 年 7 月： NanoStrand-seq—— 染色体规模变异的 “ 终极解码 ”

24 年的 NanoStrand-seq 改良了 Strand-seq ，结合 Tn5 转座酶和纳米孔测序，通过链特异性标记实现染色体级别的 SNP 和 SV 同步定相。该技术突破了短读长对复杂区域（如 MHC ）的定相限制，首次在无亲本数据下完成全染色体单倍型组装。在 GM12878 细胞中， SNP 定相错误率仅 0.02% ，并解析了 MHC 区域的高度多态性。

图 NanoStrand-seq 工作流程

NanoStrand-seq 为个性化医疗提供了精准遗传信息。若与 scNanoHi-C 结合，可探索单倍型特异的染色质构象差异。

2024 年 10 月： scNanoSeq-CUT&Tag—— 表观修饰的单细胞导航仪

scNanoSeq-CUT&Tag 将 CUT&Tag 技术与纳米孔测序结合，通过 Tn5 介导的靶向片段化和长读长优势，实现单细胞染色质修饰（如 H3K4me3 ）和转录因子结合的全基因组分析。首次在单细胞水平解析重复元件和复杂区域的表观状态，突破短读长技术的低可映射性限制。在 K562 细胞中，捕获了重复元件（如 LINE-1 ）的等位特异性 H3K27ac 修饰，并揭示去甲基化药物对染色质状态的动态影响。

图 scNanoSeq-CUT&Tag 工作流程

scNanoSeq-CUT&Tag 为癌症表观遗传学研究打开新窗口。结合 scNanoCOOL-seq 的多组学数据，可探索表观 - 转录协同调控机制。

5 、单细胞多组学技术体系演进

汤富酬团队的单细胞组学技术革新，以 “ 单分子长读长 ” 和 “ 多组学联合分析 ” 为双引擎，构建了从 基因快照 到 时空连续体 的技术矩阵。其核心脉络可凝练为三大路径： 转录组全景解析 、 表观组立体解码 和 多组学动态耦合 。

在 转录组全景解析 中，技术迭代呈现 “ 读长延伸 - 维度突破 ” 双轨并行。 scRNA-seq （ 2009 ）开创单细胞转录本捕获先河，但其短读长特性仅能捕捉表达量片段； SUPeR-seq （ 2016 ）突破 polyA 限制，解锁环形 RNA 等非编码分子图谱；至 SCAN-seq （ 2020 ）借助纳米孔测序实现单细胞全长转录本解析，将可变剪接异构体检测精度提升至 90% 以上。 2022 年 SCAN-seq2 通过微流控芯片优化，单细胞检测基因数突破 8000 大关，而 2024 年 Refresh-seq 更以限制性酶切耦合长读长测序，在 21.4% 基因组覆盖率下同步追踪等位基因特异性表达。

表观组立体解码 技术则贯穿 “ 标记定位 - 三维互作 - 功能验证 ” 逻辑链。 scRRBS （ 2013 ）首次实现单细胞甲基化单碱基分辨率检测； scCOOL-seq （ 2017 ）开创性整合拷贝数变异、甲基化与染色质可及性三维表观图谱； SMOOTH-seq （ 2021 ）通过 Tn5 转座酶捕获 10kb 级长片段，精准定位结构变异与表观修饰共现事件；至 scNanoSeq-CUT&Tag （ 2024 ）攻克重复序列分辨率瓶颈，在着丝粒等 “ 基因组荒漠 ” 实现组蛋白修饰单分子定位，填补表观调控最后盲区。

多组学 动态耦合 历经 单细胞三组学联用 （ scTrio-seq, 2016 ）、染色质 - 表观 - 转录联合解析（ scNanoCOOL-seq, 2023 ），最终通过 NanoStrand-seq （ 2024 ）实现 DNA 复制时序与表观遗传继承的同步追踪。这些技术将离散的多组学信号编织为连续调控叙事 —— 如在白血病 K562 细胞中， BCR-ABL 融合区呈现 DNA 高甲基化、染色质高开放性与致癌基因表达的三维共定位特征，揭示表观 - 基因组 - 转录组的级联调控本质。

6 、总结

从剑桥归国后的十余年间，汤富酬团队始终冲锋在技术革命的最前沿。他们将三代测序的长读优势与单细胞分辨率巧妙嫁接，让曾困于短读片段的研究者首次看清基因组重复区域的表观密码。这些技术突破不仅是方法学的飞跃，更是打开生命暗箱的万能钥匙 ——从胚胎着床时的表观重编程风暴，到结肠癌细胞群中的克隆演化轨迹，再到卵巢子宫内膜异位症的细胞命运抉择，每一次解码都刷新着人类对生命本质的认知边界。

作为中国单细胞组学领域的领航者，汤富酬不仅以年均数篇顶刊的产出树立学术标杆，更通过创办国际研讨会、培养青年人才，构建起辐射全球的学术生态。在他手中，单细胞测序早已超越技术工具的范畴，演变为理解生命复杂性的哲学语言 ——每一个微小的细胞，都是宇宙规律的缩影；每一段基因的波动，都在诉说着生命演化的史诗。

站在 2025 年的门槛回望，汤富酬团队用这十六项技术革新改写了组学研究的历史进程。当同行还在追赶二代测序的红利时，他已带领团队驶向单分子长读测序的深水区，用中国人的智慧为精准医学铸造新的“如意金箍棒”。这场始于单细胞的科学长征，正在开启生命科学的下一个黄金时代。

参考文献

1、 Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, Wang X, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A, Lao K, Surani MA. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009 May;6(5):377-82. doi: 10.1038/nmeth.1315. Epub 2009 Apr 6. PMID: 19349980.

2、 Guo H, Zhu P, Guo F, Li X, Wu X, Fan X, Wen L, Tang F. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nat Protoc. 2015 May;10(5):645-59. doi: 10.1038/nprot.2015.039. Epub 2015 Apr 2. PMID: 25837417.

3、 Fan X, Zhang X, Wu X, Guo H, Hu Y, Tang F, Huang Y. Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos. Genome Biol. 2015 Jul 23;16(1):148. doi: 10.1186/s13059-015-0706-1. PMID: 26201400; PMCID: PMC4511241.

4、 Hou Y, Guo H, Cao C, Li X, Hu B, Zhu P, Wu X, Wen L, Tang F, Huang Y, Peng J. Single-cell triple omics sequencing reveals genetic, epigenetic, and transcriptomic heterogeneity in hepatocellular carcinomas. Cell Res. 2016 Mar;26(3):304-19. doi: 10.1038/cr.2016.23. Epub 2016 Feb 23. PMID: 26902283; PMCID: PMC4783472.

5、 Yang L, Ma Z, Cao C, Zhang Y, Wu X, Lee R, Hu B, Wen L, Ge H, Huang Y, Lao K, Tang F. MR-seq: measuring a single cell's transcriptome repeatedly by RNA-seq. Sci Bull (Beijing). 2017 Mar 30;62(6):391-398. doi: 10.1016/j.scib.2017.01.029. Epub 2017 Feb 24. PMID: 36659282.

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