影响实验精确度的RNA分析套路及优化

分析样本，如下表格所示，一共有15个样本，其中short-read测序样本12个，有100bp和300bp两种测序结果。

作者使用不同的软件在回帖、组装、定量以及差异计算方面分别作了测试，如下图流程所示：

在回帖软件方面，作者主要选择了 ToHhat、STAR 和 HISAT2 这三个最流行的软件以及 RASER 。

软件速度如下表所示，数值的单位为小时。 HISAT2 的回帖速度最快，其次是 STAR ，最慢的是 TopHat ，和前两者相比 TopHat 的速度是让人无法忍受的。

对回帖的结果进行分析，在junctions评估方面，我们可以看到 TopHat 和 STAR 虽然在数量上高于 HISAT2 ，但是 HISAT2 的自己特有的junctions却是最少的。将junctions放在dbEST database检验可信度，发现 HISAT2 有最高的表现达到了80%，通过两步法mapping的 STAR 虽然得到的junctions数量众多，但是其可信的junctions比例却是最低的。

作者选取了两个最常见的软件 Cufflinks 和 StringTie 进行组装（这里针对有参，无参组装小编这里就不讲述了），从速度上看，StringTie比 Cufflinks 要快很多，其中 Cufflinks+STAR 这对组合是最慢的， StringTie 和上游的三个软件的组合在速度方非常接近。

在转录本的组装数目方面， StringTie 组装的转录本比 Cufflinks 得到的转录本在数量量多出近一倍。在100bp长度read组装方面，三个mapping软件对两个组装软件结果数量的影响相对于在300bp样本（又数第二列）下的影响小很多。

红色是敏感度，蓝色是精准度，可以发现在Gene层面上， Cufflinks 是稍微优于 StringTie 的，但是在Transcipt层面上， StringTie 比 Cufflinks 无论是敏感度和准确度上都是大幅领先的。有个例外就是300bp长度read组装上， StringTie 并没有表现出在100bp read组装上的优势。

考虑到目前常规的测序长度为150bp，所以StringTie是一个更好的选择。

在转录本定量方面，作者既测试了 StringTie 和 Cufflinks 自带的定量结果，又加入了其他定量软件，如下表所示：

在Spearman rank correlation的热聚图上， StringTie 相对于 Cufflink s 与其他软件的一致性更好一点。

针对同一组织两个不同测序 长度 MCF7-100 （ 100bp ）和 MCF7-300 （ 300bp ）样本的定量结果进行分析发现， STAR 作为回帖软件得到的结果在两个测序长度下的表达量计算结果（左 2 和左 5 ）并不稳定。 kallisto 和 Salmon-SMEM 的一致性最好， cufflinks 在一致性上稍微优于 StringTie ，但转录本数量远少于 StringTie （参考第四部分）， HISAT2 和 TopHat 优于 STAR 。

在差异计算软件的挑选上，作者除了使用 Cufflinks 套装自带的软件 Cuffdiff 外，还使用了下表所示软件。

通过三个方面的分析发现 DESeq2 的结果一致性是最好的，另外 edgeR 和 limma 略逊于 DESeq2 。 Ballgown 和 Cuffdiff 的表现让人很失望。

作者最终得到的最优选择如下图所示，回帖用HISAT2，组装和定量用 StingTie ，差异计算选择 DESeq2 。

通过这篇文章我们可以发现，不同的mapping软件得到的结果差异还是很大的，在junctions精确度上HISAT表现最优。虽然在定量上 Cufflinks 并不逊色于 StringTie ，但在组装上 Cufflinks 相对于 StringTie 在转录本数量上的弱势是很明显的，并且StrignTie的速度相比 cufflinks 要快一些。原本与 StringTie 搭配的差异计算R包 Ballgown 表现并不尽人意， DESeq2 有着最好的差异计算表现，可以搭配 StringTie 和 HISAT 组成我们RNA分析的首选套餐。