影响实验精确度的RNA分析套路及优化

分析样本，如下表格所示，一共有15个样本，其中short-read测序样本12个，有100bp和300bp两种测序结果。

作者使用不同的软件在回帖、组装、定量以及差异计算方面分别作了测试，如下图流程所示：

在回帖软件方面，作者主要选择了ToHhat、STAR和HISAT2这三个最流行的软件以及RASER。

       软件速度如下表所示，数值的单位为小时。HISAT2的回帖速度最快，其次是STAR，最慢的是TopHat，和前两者相比TopHat的速度是让人无法忍受的。

       对回帖的结果进行分析，在junctions评估方面，我们可以看到TopHat和STAR虽然在数量上高于HISAT2，但是HISAT2的自己特有的junctions却是最少的。将junctions放在dbEST database检验可信度，发现HISAT2有最高的表现达到了80%，通过两步法mapping的STAR虽然得到的junctions数量众多，但是其可信的junctions比例却是最低的。

作者选取了两个最常见的软件Cufflinks和StringTie进行组装（这里针对有参，无参组装小编这里就不讲述了），从速度上看，StringTie比Cufflinks要快很多，其中Cufflinks+STAR这对组合是最慢的，StringTie和上游的三个软件的组合在速度方非常接近。

       在转录本的组装数目方面，StringTie组装的转录本比Cufflinks得到的转录本在数量量多出近一倍。在100bp长度read组装方面，三个mapping软件对两个组装软件结果数量的影响相对于在300bp样本（又数第二列）下的影响小很多。

       红色是敏感度，蓝色是精准度，可以发现在Gene层面上，Cufflinks是稍微优于StringTie的，但是在Transcipt层面上，StringTie比Cufflinks无论是敏感度和准确度上都是大幅领先的。有个例外就是300bp长度read组装上，StringTie并没有表现出在100bp read组装上的优势。

       考虑到目前常规的测序长度为150bp，所以StringTie是一个更好的选择。

在转录本定量方面，作者既测试了StringTie和Cufflinks自带的定量结果，又加入了其他定量软件，如下表所示：

       在Spearman rank correlation的热聚图上，StringTie相对于Cufflinks与其他软件的一致性更好一点。

       针对同一组织两个不同测序长度MCF7-100（100bp）和MCF7-300（300bp）样本的定量结果进行分析发现，STAR作为回帖软件得到的结果在两个测序长度下的表达量计算结果（左2和左5）并不稳定。kallisto和 Salmon-SMEM的一致性最好，cufflinks在一致性上稍微优于StringTie，但转录本数量远少于StringTie（参考第四部分），HISAT2和TopHat优于STAR。

在差异计算软件的挑选上，作者除了使用Cufflinks套装自带的软件Cuffdiff外，还使用了下表所示软件。

       通过三个方面的分析发现DESeq2的结果一致性是最好的，另外edgeR 和limma略逊于DESeq2。Ballgown和Cuffdiff的表现让人很失望。

作者最终得到的最优选择如下图所示，回帖用HISAT2，组装和定量用StingTie，差异计算选择DESeq2。

       通过这篇文章我们可以发现，不同的mapping软件得到的结果差异还是很大的，在junctions精确度上HISAT表现最优。虽然在定量上Cufflinks并不逊色于StringTie，但在组装上Cufflinks相对于StringTie在转录本数量上的弱势是很明显的，并且StrignTie的速度相比cufflinks要快一些。原本与StringTie搭配的差异计算R包Ballgown表现并不尽人意，DESeq2有着最好的差异计算表现，可以搭配StringTie和HISAT组成我们RNA分析的首选套餐。