该文章主要探讨了天然产物领域的一种生物碱ALO如何通过结合VPS4A抑制自噬体与溶酶体结合，进而抑制肿瘤的作用机制。研究包括体外实验验证、体内抗肿瘤效果验证以及下游机制的深入研究。文章还探讨了ALO如何影响肿瘤细胞的迁移能力和细胞凋亡过程。
研究人员发现ALO能够结合VPS4A，这种结合阻止了自噬体的形成，影响了自噬晚期进程。这一过程导致了自噬体内的蛋白无法被消化。
研究表明，ALO抑制自噬通量会导致p62的增多，进而引发ROS产生，最终引发细胞凋亡。科研人员通过一系列实验验证了这一机制。
研究团队构建了小鼠体内肿瘤模型，并给予ALO处理，发现ALO在动物体内同样能够发挥显著的抗肿瘤功效。
虽然文章提出了 p62 累积导致 ROS 产生的观点，但这一观点存在争议，需要进一步探讨和验证。
人家的主治医师就发了14.3分自噬抑制的SCI文章，我却还在收病人、整病历！今天探讨的这篇论文，聚焦于天然产物领域，其在机制研究方面表现颇为出色，不过，我对该文章仍存一些疑问。此论文由华中科技大学协和医院的主治医师发表于影响因子14.3分的《Adv Sci (Weinh) 》期刊，主要阐述了 ALO（Alperine，一种从天然中草药中分离出的生物碱）通过与 VPS4A 结合，抑制自噬体与溶酶体结合（自噬体与溶酶体结合属于巨自噬晚期进程，在此过程中，自噬体内的蛋白得以被消化，若对这一概念不太清晰，可以看下《信号通路是什么鬼？》系列），进而抑制肿瘤的作用机制 。
研究伊始，科研人员对 NSCLC（非小细胞肺癌）细胞系进行 ALO 用药处理，以分析 ALO 对肿瘤细胞的作用。结果显示，肿瘤细胞的增殖受到明显抑制。同时，通过 Transwell 实验，以及对 EMT 相关基因表达和激活情况的分析，他们发现 ALO 还能够影响肿瘤细胞的迁移能力（若对 EMT，即上皮间质转换不太了解，可回顾《信号通路是什么鬼？》系列中 EMT 信号通路相关章节进行复习）。这一阶段的实验验证了 ALO 在体外对肿瘤细胞的作用效果，完成了功能验证的初步步骤。
在体外实验结束后，研究团队进一步构建了小鼠体内肿瘤模型，并给予 ALO 处理，展开体内抗肿瘤效果验证。结果表明，ALO 在动物体内同样能够发挥显著的抗肿瘤功效。
接下来，研究深入到 ALO 诱导的下游机制层面。科研人员在使用 ALO 处理肿瘤细胞后，进行了转录组分析。结果显示，ALO 处理后，自噬通路及相关基因显著富集，这表明 ALO 极有可能对肿瘤细胞的自噬过程产生影响。随后的 WB 验证结果显示，经 ALO 处理的肿瘤细胞，LC3B - II 和 p62（SQSTM1）的表达呈现出剂量和时间依赖性增加 。
通常情况下，LC3B - II 表达增加且 p62 表达下降，表明自噬被激活；而当 LC3B - II 和 p62 的表达同时增加时，则意味着自噬过程受到阻滞（这种验证结果在使用自噬抑制剂后较为常见，由于 p62 作为结合泛素化蛋白的受体，会进入自噬体并最终被溶酶体消化，所以在自噬激活时 p62 表达会下降，若对此不清楚，可以看下《信号通路是什么鬼？》系列）。那么，在 ALO 抑制自噬的过程中，其作用究竟发生在早期还是晚期呢？科研人员通过使用不同类型的自噬抑制剂（敲减 ATG7 以抑制早期自噬，使用 BafA1 抑制晚期自噬，使用 Rapa 促进自噬）展开深入分析，结果发现 ALO 的影响主要局限于自噬晚期，即自噬体与溶酶体的结合过程 。
由于早期自噬抑制剂无法阻止 ALO 诱导的细胞死亡，于是研究人员进一步探究细胞死亡的具体途径。通过分别使用细胞凋亡抑制剂、铁死亡抑制剂和坏死性凋亡抑制剂进行分析，结果显示，ALO 诱导的细胞死亡过程仅能被凋亡抑制剂所抑制。研究发现，ALO 通过抑制自噬通量，会导致 p62 的增多。科研人员查阅文献发现，p62 能够促进 ROS 产生（这一过程体现了科研中通过文献搜索进行假设迭代的重要性，假设迭代在整个研究推进过程中起着关键作用，若对该过程不了解，可以看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。基于此，他们提出假设，认为是 p62 的累积导致了 ROS 的产生，进而引发细胞凋亡。
为验证这一假设，研究人员在 ALO 处理肿瘤细胞后，敲减了 p62 基因（这一过程遵循柯霍氏法则，通过抑制累积的 p62，来探究 ALO 潜在的下游信号通路，若对柯霍氏法则不熟悉，可查阅《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》）。结果发现，细胞凋亡以及凋亡相关蛋白和 ROS 水平均得到缓解。那么，关键问题在于确定 ALO 究竟与何种蛋白相互作用，从而导致自噬过程受到影响。科研人员通过药物亲和靶点分析技术，成功找出能与 ALO 结合的蛋白，并确认 ALO 能够与 VPS4A 相结合，同时明确了 VPS4A 与 ALO 结合的氨基酸位点 。
研究团队进一步对 VPS4A 上 ALO 结合位点进行突变，以分析 ALO 处理后下游的自噬表型以及 p62 的累积情况（这一突变验证步骤极具价值，能够有效避免验证过程中肯定后件的逻辑谬误，使验证过程更加严谨科学，若对肯定后件逻辑谬误不太清楚，可看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列相关内容）。
已知VPS4是ESCRT的亚基，ESCRT参与了自噬相关的多个膜结合过程。而且，ESCRT的抑制会增加癌细胞对细胞毒性淋巴细胞的易感性。于是，研究人员在 NK 细胞和H1299肺癌细胞共培养体系中加入ALO，结果发现 ALO 能够有效增强 NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，他们尝试使用 YM101（一种可阻断 TGF-β 和小鼠 PD-L1 的双特异性抗体），发现 ALO 同样能够提高 YM101 的抗肿瘤活性。
综上所述，该研究形成了如下作用机制示意图：ALO 通过结合 ESCRT 的亚基 VPS4A，阻止自噬体与溶酶体的结合，致使 p62 表达累积，进而引发 ROS 产生，最终导致细胞凋亡 。
总体而言，这篇文章的验证过程严谨合理，在天然产物化合物的研究领域中，堪称较为优秀的范例。然而，其中存在一个问题值得探讨：文中提到 p62 累积导致 ROS 产生，这一观点引用了文献 “Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species（PMID: 27646922 ）”，但在该文献中并未提及 SQSTM1 或者 p62 。实际上，如果回顾铁死亡调控相关知识，应该知道 p62 能够通过竞争性结合 Keap1，激活 Nrf2，而 Nrf2 作为转录因子，可以激活下游清除 ROS 基因的表达。也就是说，从这一角度看，p62 表达增多应该是抑制 ROS 的。若认为 p62 累积抑制了 ROS，可能是从自噬角度出发，即自噬被阻遏导致 p62 累积，从而无法清除细胞中产生的 ROS。但如此一来，在使用 ALO 后敲除 p62 的意义似乎不大，甚至可能会引发其他难以预测的影响。这便是我目前尚未完全理解之处，欢迎大家在评论区积极讨论，共同探讨。
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