近日， 上海有机所丁克研究员/王震研究员联合密歇根大学团队 在国际顶级药物化学期刊 《Journal of Medicinal Chemistry》 上发表题为 “发现YJZ5118：一种与Akt抑制剂联合使用时具有协同效应的强效且高选择性不可逆CDK12/13抑制剂” 的研究论文。该研究聚焦于CDK12/13这一新兴癌症治疗靶点，开发了一种新型不可逆抑制剂 YJZ5118 ，并揭示其与Akt抑制剂的协同抗肿瘤效应。实验表明， YJZ5118 可有效抑制RNA聚合酶II的Ser2磷酸化，抑制DNA损伤响应基因的转录，诱导DNA损伤和细胞凋亡。此外， YJZ5118 在多种肿瘤细胞系中展现出显著的抗增殖效果，尤其对前列腺癌和乳腺癌细胞敏感。更重要的是， YJZ5118 与Akt抑制剂联合使用时，在体外和体内模型中均表现出协同抗肿瘤效应，为癌症治疗提供了新的联合用药策略。

图片来源：ACS

01

Background

CDK12和CDK13 作为转录相关激酶，在DNA损伤响应（DDR）和基因组稳定性维持中起关键作用。它们通过磷酸化RNA聚合酶II的C末端结构域（CTD）的Ser2位点来调控转录延伸、剪接以及切割和聚腺苷酸化过程。近年来，CDK12/13因其在多种人类癌症中的潜在治疗价值而备受关注，尤其是在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）和三阴性乳腺癌（TNBC）中，抑制这些激酶的活性或表达已被证实可以显著抑制癌细胞的增殖。此外，CDK12的突变在转移性CRPC患者中占5%~7%，且CDK12突变可能作为CDK12/13降解剂的协同生物标志物。 尽管如此，目前开发的CDK12/13抑制剂仍面临活性、选择性、药代动力学（PK）特性以及安全性之间的平衡挑战，且缺乏足够的体内疗效数据，尚未有药物进入临床试验阶段。因此，开发具有替代化学骨架的新型不可逆CDK12/13抑制剂对于进一步验证选择性抑制CDK12/13作为癌症治疗策略具有重要意义 。

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02

Drug Design

①药物设计

作者描述了基于结构的药物设计过程，旨在开发一种新型的不可逆CDK12/13抑制剂。研究团队从一种可逆的CDK12/13抑制剂（化合物 2 ）出发，该化合物具有较强的酶抑制活性和良好的激酶选择性，但对CDK7和CDK9的选择性较弱。通过对化合物 2 与CDK12/CCNK复合物的共晶结构分析，结合已知的共价抑制剂THZ531的结构信息，研究团队推测可以通过在化合物 2 的中心苯环上引入丙烯酰胺弹头，使其能够与CDK12的Cys1039共价结合，从而实现不可逆抑制。此外，为了促进共价键的形成并改善药物的水溶性和药代动力学特性，研究团队在丙烯酰胺弹头附近引入了亲水性的烷基胺基团。

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②构效关系研究

作者详细描述了通过一系列结构优化发现新型不可逆CDK12/13抑制剂 YJZ5118（化合物14k） 的过程。研究团队以可逆抑制剂2为先导化合物，通过在其结构基础上引入丙烯酰胺弹头和不同的烷基胺基团，合成了多个衍生物，并对它们的CDK12/13抑制活性、细胞增殖抑制活性以及药代动力学特性进行了评估。结果显示，化合物 14a 表现出与先导化合物2相当的CDK12/13抑制活性，但细胞增殖抑制活性显著增强，表明其可能通过共价结合延长了靶点占据时间。进一步的结构优化中，化合物 14h 表现出最强的激酶抑制活性和细胞活性，但其体内药代动力学特性不佳。最终，通过引入4-(二甲氨基)哌啶基团，化合物 14k（YJZ5118） 在保持较高激酶抑制活性的同时，展现出显著改善的药代动力学特性，包括较高的口服生物利用度和较长的半衰期。此外， YJZ5118 对CDK12/13的选择性超过100倍，对其他CDK家族成员的抑制作用较弱，仅对CDK7表现出中等抑制活性。这些结果表明， YJZ5118 作为一种新型的不可逆CDK12/13抑制剂，具有良好的靶点选择性、细胞活性和药代动力学特性。

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03

In vitro In Vivo

①YJZ5118共价结合模式的验证

作者通过多种实验手段验证了 YJZ5118 与CDK12/13的共价结合模式。首先，通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析，观察到CDK12与 YJZ5118 孵育后出现了与 YJZ5118 分子量一致的质量偏移，证实了化合物与CDK12的共价结合。进一步，通过解析 YJZ5118 与CDK12/CCNK复合物的共晶结构（分辨率2.5 Å），研究团队发现 YJZ5118 的丙烯酰胺基团与CDK12的Cys1039形成了共价键，同时化合物的其他部分通过氢键与激酶的关键氨基酸残基相互作用。此外，为了在细胞环境中验证共价结合，研究团队合成了 YJZ5118 的生物素标记探针YJZ9149，并利用链霉亲和素（streptavidin）珠子进行下拉实验，结果表明CDK12和CDK13是细胞裂解液中与 YJZ5118 共价结合的主要蛋白。最后，通过细胞洗脱实验比较了 YJZ5118 与可逆抑制剂在细胞中的作用持久性，发现 YJZ5118 即使在移除药物后仍能长时间抑制细胞增殖和RNA聚合酶II的Ser2磷酸化，而可逆抑制剂的作用则迅速消失。 这些结果共同证实了YJZ5118通过共价结合不可逆地抑制CDK12/13的活性，为其作为不可逆抑制剂的特性提供了有力的证据。

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②YJZ5118在多种癌细胞系中对DNA损伤响应（DDR）基因转录的抑制作用，以及其诱导DNA损伤和细胞凋亡的能力

实验结果显示， YJZ5118 能够以剂量和时间依赖的方式抑制RNA聚合酶II的Ser2磷酸化，进而影响依赖于该位点磷酸化的转录延伸过程。通过RNA测序（RNA-seq）分析，研究发现 YJZ5118 处理的细胞中，基因长度与基因表达下调之间存在显著相关性，较长的基因更倾向于被抑制，这与CDK12在转录调控中的作用机制一致。此外， YJZ5118 显著降低了多个DDR相关基因（如ATM、ATR、RAD51和FANC1）的表达水平，而对其他非DDR相关基因（如NRAS和EZH2）的影响较小。为了进一步验证 YJZ5118 诱导的DNA损伤，研究团队采用中性彗星实验检测了细胞中的DNA断裂情况，结果表明 YJZ5118 处理的细胞中DNA损伤显著增加。同时，流式细胞术分析显示 YJZ5118 能够诱导细胞凋亡，且在100 nM的浓度下即可显著提高细胞的凋亡率。此外， YJZ5118 在多种肿瘤细胞系（包括前列腺癌、乳腺癌和尤文氏肉瘤细胞系）中展现出显著的细胞毒性，而对正常和非癌性细胞的敏感性较低。这些结果表明， YJZ5118 通过抑制CDK12/13的活性，有效地抑制了DDR基因的转录，诱导了DNA损伤和细胞凋亡，且对多种癌细胞系具有选择性的抗增殖活性，而对正常细胞的影响较小，这为其作为潜在的抗癌药物提供了重要的生物学依据。

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③YJZ5118与Akt抑制剂联合使用在体内外均显示出协同作用。

研究团队探讨了 YJZ5118 与Akt抑制剂联合使用时的协同抗肿瘤效果。实验发现， YJZ5118 单独处理细胞时会增加Akt及其底物PRAS40的磷酸化水平，提示CDK12/13的抑制可能通过某种机制激活Akt信号通路。基于此，研究团队将 YJZ5118 与多种Akt抑制剂（如MK2206、uprosertib、ipatasertib和afuresertib）联合应用于22RV1前列腺癌细胞系，并通过Loewe协同效应分析法评估了联合用药的协同性。结果显示， YJZ5118 与Akt抑制剂的组合在体外实验中表现出显著的协同抑制细胞生长的效果，其中与MK2206的联合治疗协同得分达到10.81。

进一步的体内实验采用VCaP去势抵抗性前列腺癌（CRPC）小鼠模型，通过腹腔注射 YJZ5118 和口服给予uprosertib的方式进行联合治疗。结果表明，与单独用药相比，联合治疗显著抑制了肿瘤生长，且未引起明显的体重变化或其他不良反应。治疗结束时的肿瘤分析显示， YJZ5118 有效抑制了RNA聚合酶II的Ser2磷酸化，增加了pAkt（S473）和pPRAS40的水平，并降低了DDR基因的表达，同时增强了细胞凋亡。这些结果表明， YJZ5118 不仅能够通过抑制CDK12/13引发Akt磷酸化，还能与Akt抑制剂联合使用，展现出显著的协同抗肿瘤效果，为开发新的联合治疗策略提供了有力的实验依据。

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