基于水凝胶的再生微环境增强骨质疏松骨再生

受愈合能力受损与愈合期延长的限制， 骨质疏松性骨缺损对骨再生提出了重大挑战。 为此，香港中文大学李刚教授团队联合 华南理工大学 边黎明教授团队开发 了一种水凝胶 （ GelHFS ） ， 该水凝胶植入骨质疏松性骨缺损大鼠模型可募集内源性表达整合素 β 1 的细胞，增强新骨形成和骨强度。

首先， 研究者 以合成 的 丙烯酰基 β- 环糊精（ A c-β-CD ）为主体单体，通过光聚合反应与明胶 反应 得到主客体水凝胶 （ GelCD ），然后 将 人类胎儿间充质干细胞分泌物（ HFS ） 掺入 GelCD 前体中制备 了 GelHFS 水凝胶 。 HFS 组分 可 保持其纳米球形态 ， 均匀分布在水凝胶内 ，两种水凝胶均具孔径为 100 μm 的大孔结构 。 此外， GelHFS 水凝胶 中，低浓度的 HFS 不影响水凝胶的储能模量和溶胀比 ，并对水凝胶包封的 MSC 具有较好的生物相容性（图 1 ） 。

接着，研究者 使用共聚焦显微镜成像重建包封细胞的 3D 结构 ，研究了 大鼠骨髓间充质干细胞 （ MSC ） 在 GelCD 和 GelHFS 中的行为 。 GelHFS 可促进细胞迁移，其包封的 MSC 具有更显著的伸展和细胞骨架中间丝（波形蛋白），呈现 梭形样形状 ，且单 个细胞的面积 明显 大于 GelCD 组 。 GelHFS 可促进 MSC 浸润至凝胶内部，而 GelCD 组细胞大多保留在凝胶表面。

然后， 研究者 将载有 MSC 的水凝胶植入裸鼠的皮下 以 评估水凝胶中 MSC 的体内成骨分化 能力。结果显示 GelHFS 组成骨标志蛋白 OCN 和 Col- I 表达显著高于 GelCD 组。以上结果表明 GelHFS 为体外有效的细胞扩散和浸润提供了有利的微环境，且 GelHFS 水凝胶促进包封大鼠 MSC 的体内成骨分化（图 2 ）。

为了分析 HFS 中的蛋白质组成，研究者进行了蛋白质组学分析，发现大多数 HFS 组分来源于细胞外外泌体和细胞外基质。 KEGG 分析显示， HFS 被注释为黏着斑途径（ 5% ）和 ECM- 受体相互作用（ 3% ）。此外， HFS 中的显著 ECM 蛋白均可与整合素相互作用。为确定 HFS 调节的整合素亚基，研究者检测了在 GelCD 和 GelHFS 包封的 MSC 中整合素亚基的 mRNA 表达。结果显示，与 GelCD 组相比， GelHFS 明显上调 Itgb 1 与 Itga 3 基因的表达。免疫荧光染色进一步证实了 GelHFS 上调 MSC 中整合素 β 1 的表达。此外， WB 结果证实， GelHFS 上调了 MSC 中 β - 连环蛋白的蛋白质表达并激活了 FAK-ERK 信号通路，而这种增加被 FAK 抑制剂 Y15 消除。以上结果表明， GelHFS 可通过 MSC 中整合素 β 1 和 HFS （ ECM 组分）之间的相互作用来促进细胞快速铺展和成骨分化（图 3 ）。

紧接着，研究者 在雌性大鼠中 建立了 卵巢切除术诱导的骨质疏松 模型，并通过 Micro-CT 和组织学染色来 评估了 GelHFS 促进骨再生的有效性。 结果显示， GelHFS 组在两周内表现出更多的骨样组织形成， 8 周后出现明显矿化，生物力学测试表明 GelHFS 不仅支持骨愈合，而且增强了新生骨的刚度和极限载荷。组织学结果显示，对照组几乎无新骨形成， 在 GelHFS 组中，编织骨在 2 周内取代了 大部分 水凝胶和纤维组织，到 8 周时，编织骨已经重塑为成熟的板层骨 。以上结果共同表明， GelHFS 显著增强了骨质疏松性骨缺损的再生，包括促进新骨形成和提高骨力学性能（图 4 ）。

为观察新骨形成的动态过程， 研究者 测量了体内钙黄绿素和二甲苯酚的双标定 ，结果显示 GelCD 组和 GelHFS 组术后 10 天的骨形成无统计学差异，但 GelHFS 组术后第 14 天的新 骨 形成明显高于 GelCD 组 ，之后对缺损部位进行连续切片免疫组化染色，结果提示， GelHFS 组在缺陷部位对整合素 β1 、 OCN 和 Col - I 的阳性染色明显高于 GelCD 组 。以上结果表明 GelHFS 可将更多表达整合素 β 1 的细胞募集到缺损部位，促进内源性细胞成骨，从而产生更多的骨基质沉积（图 5 ）。

鉴于 GelHFS 可将内源性细胞募集到缺损部位，研究者推测募集的细胞通过介导水凝胶的降解来进一步促进细胞浸润和原位骨再生。因此，研究者比较了 GelCD 和 GelHFS 水凝胶的体内、外降解性。 M icro-CT 显示，在股骨远端植入后， GelHFS 水凝胶在 2 周时的降解速度明显快于 GelCD 。 此外，免疫 组化 染色显示 GelHFS 植入组中 基质金属蛋白酶 MMP2 、 MMP13 表达量高于 GelCD 组。 以上结果表明，内源性细胞不仅可分泌 MMPs ，而且可提高 GelHFS 水凝胶的降解能力（图 6 ）。

综上所述，该研究成功开发了 GelHFS 水凝胶，其具有与 GelCD 水凝胶相当的生物力学性能，同时可促进包封的 MSC 铺展、迁移和成骨分化。 此外，无细胞的 GelHFS 水凝胶通过招募整合素 β1 ⁺ 内源细胞并激活整合素 β1 诱导的 黏着斑信号 通路，促进了骨质疏松骨缺损模型中的骨再生。 该研究证明了无细胞的 GelHFS 水凝胶可在骨质疏松骨中创造了一个再生干细胞生态位，从而通过影响内源性细胞行为来增强骨生成和骨再生（图 7 ）。

该研究由 香港中文大学李刚教授团队与华南理工大学边黎明教授团队 完成，并于 2024 年 8 月 6 日发表于 Bioactive Materials 。

论文信息： Xiaoting Zhang ¹ , Boguang Yang ¹ , Lu Feng, Xiayi Xu, Chenmin Wang, Yuk-wai Lee, Ming Wang, Xuan Lu, Ling Qin a,b, Sien Lin**, Liming Bian***, Gang Li*. Augmenting osteoporotic bone regeneration through a hydrogel-based rejuvenating microenvironment. Bioactive Materials 41 (2024) 440 – 454.

供稿：何辉

审校：夏婷婷

编辑：高仕杰