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Cell | III型CRISPR系统抗病毒免疫新机制-效应蛋白Cad1的腺苷脱氨酶活性与ATP-ITP转换

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-11-01 08:58

正文

撰文 | 木兰之枻

CRISPR是原核生物的适应性免疫系统，在细菌对抗噬菌体等病毒侵染时发挥着关键性作用。目前自然界中共发现三大类CRISPR系统，其中III型CRISPR系统主要依赖Cas10为核心的效应蛋白复合物，在crRNA引导下通过靶向RNA来发挥抗病毒免疫功能，其主要的抗病毒机制主要有两种：一是直接借助Cas10的HD核酸酶活性降解单链DNA（ssDNA）以杀伤病毒；二则依赖Cas10的Palm结构域，以ATP为底物合成第二信使如环寡聚腺苷酸（cOA），经由cOA激活下游效应蛋白如CARF，并最终介导各类RNA和ssDNA的非特异性降解（详见BioArt报道：Mol Cell｜细菌大战噬菌体：辅助核酸酶诱导顿挫感染）【1-3】。近年来对III型CRISPR系统的研究不断增加，研究者发现了多种结构和功能不尽相同的新CARF效应蛋白，如CARF-RelE核糖核酸酶能抑制蛋白翻译（详见BioArt报道：Science丨细菌CARF-RelE核糖核酸酶通过核糖体茎部区蛋白参与CRISPR免疫）【4】。

2024年10月28日，来自美国洛克菲勒大学的Luciano A. Marraffini实验室与美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Dinshaw J. Patel实验室在Cell发表题为The CRISPR-associated adenosine deaminase Cad1 converts ATP to ITP to provide antiviral immunity的论文。文章发现了一种新的III型CRISPR型效应蛋白Cad1。功能和结构研究发现Cad1包含两大关键结构域CARF与腺苷脱氨酶域，其中CARF结构域结合cOA配体后会激活Cad1的腺苷脱氨酶活性，随后介导ATP-ITP转换导致ITP在细胞内的累积，最终通过抑制宿主细菌生长发挥抗噬菌体功能。

文章伊始，研究者通过蛋白质结构比对软件Foldseek在拟杆菌目中找到了新的CARF效应蛋白Cad1。Cad1长度约为600氨基酸，主要包含N端的CARF结构域和C端的腺苷脱氨酶结构域（ADA）。在细菌基因组中，cad1编码基因位于III型CRISPR基因座cas10-csm基因簇下游。深度分析发现，cad1同源基因与III型CRISPR的关联度超过70%，并存在于多种独特的细菌门类中，这提示Cad1是一种广泛存在的III型CRISPR效应蛋白。

之后研究者在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）RN4220菌株中对Cad1的活性和功能进行了检测，发现Cad1可被第二信使cOA 激活，进而抑制细菌生长。机制分析指出，Cad1活化导致的细菌生长阻滞与Cad1腺苷脱氨酶活性介导的ITP生成和累积密切相关。生化实验和结构分析发现，第二信使cA4和cA6 主要结合Cad1蛋白的CARF结构域。从拓扑结构而言，Cad1会先形成二聚体，随后三聚化成为六聚体，其中脱氨酶结构域ADA位于六聚体内部， CARF结构域则以一定的倾斜度环绕四周。研究发现，ATP会结合在CARF-ADA两结构域之间，但并不结合于ADA脱氨酶结构域内部。其中CARF结构域的R161和K165是结合ATP并介导Cad1活化的关键位点。当Cad1结合cOA后，其整体结构变化不大：其中cA4主要结合在Cad1二聚体两CARF结构域之间。不过cA4结合会明显改变Cad1与ATP的结合模式，脱氨酶结构域ADA内部除金属离子如镁外，也会有ATP进入。

随后的生化实验表明，cA4和cA6能激活Cad1的腺苷脱氨酶活性，进而诱导ITP的产生。此外，与其它能切割配体的CARF效应蛋白相比，Cad1并不切割或降解cA4和cA6。研究还指出，镁/锰等金属离子对Cad1的脱氨酶活性至关重要，金属离子的关键结合位点H243突变会导致Cad1失活。此外，破坏Cad1蛋白六聚体形成的W349突变体也会导致Cad1失活并阻断ITP的产生。虽然前期有研究称腺苷脱氨酶ADAs能作用于RNA分子以抗噬菌体侵染，但Cad1及其产物ITP对RNA和基因转录并无明显影响。

已知噬菌体侵染能激活III型CRISPR系统。在噬菌体进入裂解循环初期，III型CRISPR系统Cas10蛋白的核酸酶功能被激活，可独自切割ssDNA杀伤噬菌体以保护宿主细菌的生长，此阶段Cad1主要抑制病毒颗粒的产生，发挥着较弱的抗病毒免疫功能。在裂解循环后期，Cas10无法独自有效控制噬菌体感染，此时Cad1会被激活，两者共同作用方能抑制噬菌体以保护宿主细菌的生长。之后研究者还通过荧光成像分析发现，噬菌体侵染初期， Cas10和Cad1可同时活化以杀伤噬菌体，保护细胞生长；如果仅激活Cad1，细胞出现生长阻滞，但不会裂解死亡。如果在侵染后期激活Cas10和Cad1，细胞会进入生长阻滞状态，部分细菌中的噬菌体会被清除，细胞也会缓慢恢复生长；如果仅激活Cad1，细胞生长停滞，部分细胞也会裂解死亡。研究还指出，Cad1对多种噬菌体均有抑制效果，具有广谱的抗病毒免疫能力。

总体而言，本研究发现了III型CRISPR系统的新效应蛋白Cad1并解析了新的抗病毒免疫机制。不同于传统CARF效应蛋白切割DNA/RNA和跨膜去极化的机制，Cad1能通过介导ATP脱氨来产生ITP，ITP累积会产生细胞毒性，最终抑制病毒增殖和扩散。本研究让我们对III型CRISPR系统抗病毒免疫的机制有了更深入全面的认识。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.002

制版人：十一

参考文献

1. Mayo-Muñoz D, et al. Type III CRISPR-Cas provides resistance against nucleus-forming jumbo phages via abortive infection. Mol Cell. 2022 Dec 1;82(23):4471-4486.e9.

2. Niewoehner, O., Garcia-Doval, C., Rostol, J.T., Berk, C., Schwede, F., Bigler, L., Hall, J., Marraffini, L.A. and Jinek, M. (2017) Type III CRISPR-Cas systems produce cyclic oligoadenylate second messengers. Nature, 548, 543-548.

3. Kazlauskiene, M., Kostiuk, G., Venclovas, C., Tamulaitis, G. and Siksnys, V. (2017) A cyclic oligonucleotide signaling pathway in type III CRISPR-Cas systems. Science, 357, 605-609.

4. Mogila I, Tamulaitiene G, Keda K, Timinskas A, Ruksenaite A, Sasnauskas G, Venclovas Č, Siksnys V, Tamulaitis G. Ribosomal stalk-captured CARF-RelE ribonuclease inhibits translation following CRISPR signaling. Science. 2023 Dec;382(6674):1036-1041.

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