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国自然加分新技术之——Smart-seq技术

猫头鹰教室 · 公众号 · · 2025-01-21 08:51

正文

提到高通量测序，我们比较熟知的就是 RNA-seq ，它是通过提取组织、器官以及一群细胞的混合 RNA （ bulk RNA ）进行测序，得到的是一群细胞转录组的平均数据，这往往忽略掉了细胞群体中单个细胞特异表达的基因信息。随着科技的发展以及需求的增加，单细胞测序技术于 2009 年应运而生，并于 2013 年被《 Science 》杂志评为未来几年最值得关注且可持续发展的技术领域之一。 单细胞转录组测序（ Single cell RNA sequencing ， ScRNA-Seq ） 是一项在单细胞水平对转录组进行高通量测序和分析的新技术 ，可获得单个细胞内近万个基因的特异表达信息，同时解决 bulk 测序无法解决的细胞异质性难题，为辨别生物组织中各细胞的转录组特征、解析单细胞的行为、机制及其与机体的关系提供有力的工具。单细胞测序种类繁多，但转录组测序主要分为两个大方向：①更多的细胞，如 10x 技术平台，可以构建海量的单细胞测序文库（ 100000 级别），但是只能获取 mRNA 的 3 ’端信息，也就是说只能获取转录本的部分信息；②测更多的基因，如 Smart-seq 技术可以获得完整的 mRNA 信息。今天小编就带大家来了解一下单细胞测序中的 Smart-seq 技术。

1.Smart-Seq技术的迭代更新

Smart-Seq 技术

为什么说 S mart -seq （ Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript ）是可以测更多的基因呢？ Smart-seq 其实是可以对单个细胞 RNA 的基因亚型、等位基因等进行大规模测序，并检测 mRNA 全长的一种单细胞转录组测序技术，它由美国和瑞典科学家共同开发。这种能够从单细胞生成全长 cDNA 的测序方案，对于等位基因特异性表达、 SNV 检测或者剪接变体等深入研究来说，具有里程碑意义。但由于当时的技术限制，怎么可能完美无缺呢？所以 Smart-seq 技术也存在一定的缺陷，如对一些低丰度的转录本扩增效率不佳；同时由于引物的设计问题也可能影响后续纯化及需要更多的细胞进行初步 RNA 提取等，但就当时而言，该技术已经是获得完整转录本的最佳单细胞测序方案。

Smart-Seq 技术的发展史

Smart-seq 技术于 2012 年由 Ramsköld 团队发表； Smart-Seq2 技术于 2013 年及 2014 年由 Picelli 团队改进并发表； Smart-seq 3 技术则于 2020 年由瑞典卡罗林斯卡学院的 Rickard 团队进一步改进并发表。那么接下来我们就具体看一下 Smart-Seq2 和 Smart-seq 3 技术相对于 Smart-seq 初代技术有什么改进 ~

2.Smart-Seq2技术

Smart-seq2 技术于 2013 年被发表于《 Nature Methods 》，在 Smart-seq 技术基础之上，通过使用一种模板切换引物探针（ TSO ）并将其 3' 末端最后一个鸟苷酸替换为锁核酸（ locked nucleic acid ， LNA ），结合更高浓度的 Mg ²⁺ 和甜菜碱，提高扩增精准度的同时产量也跟得上，只需要 50 pg 级别的 RNA 即可满足构建测序文库的需求，同时通过改善 MMLVRT 和 TSO 引物，提高转录本的整体覆盖度，实现了高水平的序列模板转换。

技术优势

（ 1 ）更强的 3' 端 延伸能力 ：通过逆转录在 cDNA 链的 TSO 引物（ rGrG+G ） 3' 末端最后一个鸟苷酸替换为 LNA 。增强了热稳定性，在更强的退火温度下，使得非模板 cDNA 的 3' 端进一步延伸，完善了转录本的覆盖能力。

（ 2 ）更高的 cDNA 产量： 新体系中添加了甜菜碱，可通过提供甲基来增加蛋白酶的热稳定性，并通过破坏 DNA 螺旋结构消除 DNA 热融变对碱基对组成的依赖性；同时体系中增加的 Mg ²⁺ 浓度可以保证其与甜菜碱羧酸盐阴离子结合形成离子对，进一步成为 DNA 稳定剂，在一定程度上提高 cDNA 产量

（ 3 ） 更多的加热循环： 额外增加 10 个加热循环（ 50 ℃ 2min;42 ℃ 2min ）解开了 RNA 的二级结构（例如发夹或环），解决了空间位阻导致的酶终止链延长问题。

（ 4 ） 更广的应用范围： M-MLV 逆转录酶更倾向于选择全长 cDNAs 作为其末端转移酶活性的底物，其在转录到 mRNA 的 5 ’末端时，会在新合成的 cDNA3 ’末端，多出几个 C 碱基，使得 TSO 引物与第一链结合高效合成全长 cDNAs ，因此每个转录本的所有外显子都能被检测到， 后续还可分析可变剪切，还可在转录本层面进行 SNP 和突变位点分析。

图 1 Smart-seq 2 技术建库流程图

3.Smart-Seq3技术

相较于

国自然加分新技术之——Smart-seq技术

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